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Séquence d'ARN et utilisation d'amplification d'ARN basée sur Poly(A) ou non-Poly(A)

Séquence d'ARN et utilisation d'amplification d'ARN basée sur Poly(A) ou non-Poly(A)


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J'étudie "Le séquençage en profondeur du transcriptome circadien et diurne du cerveau de la drosophile" Hughes et al., 2012. J'ai quelques problèmes avec les matériaux et les méthodes.

Avant RNAseq, les auteurs amplifient l'ARN. Ils utilisent deux kits : à base de poly(A) et non à base de poly(A). Pour les échantillons amplifiés à base de Poly(A), ils effectuent un séquençage pour générer 100 pb d'extrémités appariées et pour les échantillons à base de non poly(A), ils effectuent un séquençage pour générer 75 pb d'extrémités simples.

J'ai lu dans la stratégie :

L'ARN total a été amplifié et l'ARN ribosomique a été appauvri, à l'aide d'un kit d'amplification non basé sur poly (A), ce qui diminue considérablement le biais 3' dans les bibliothèques en aval utilisées pour l'ARN-seq (voir Méthodes).

  1. Je ne comprends pas pourquoi ils utilisent les deux kits. En fait, ils disent qu'ils veulent évaluer le biais introduit par une méthode d'amplification alternative MAIS le séquençage suivant n'est pas le même dans les deux cas donc il y a plus d'un paramètre qui change entre les deux protocoles donc je ne comprends pas comment ils peuvent comparer.

  2. Pour la base poly(A), je comprends que les ARNr ne sont pas polyadénylés, ils éliminent donc les ARNr de l'échantillon amplifié. Cependant, n'éliminent-ils pas aussi l'ARN non codant (long ou court) ?

  3. Pour les non basés sur poly(A), je ne comprends pas comment ils suppriment l'ARNr mais je comprends que puisqu'ils ne sélectionnent pas l'ARN en fonction de leurs queues poly(A), ils gardent le reste des ARN qui ne sont pas conservés dans l'amplification à base de poly(A).

  4. Quand je regarde les statistiques du RUM, je vois qu'il y a moins de lectures alignées au total dans les bases non poly(A): 70-80% (non polyA) et 80-90% (polyA). Il semble donc que nous perdions des informations avec une base non poly(A).

En résumé, pourquoi les auteurs utilisent Poly(A) et non-poly(A) ? Pourquoi montrent-ils tout le reste des résultats de l'amplification non poly(A) puisqu'ils ont moins de lecture alignée ? Comment se comparent-ils puisque le séquençage suivant n'est pas le même ? Comment les ARNr sont-ils éliminés dans les deux techniques et en particulier dans le non-poly(A) ?

Je n'ai pas trouvé le kit de protocoles avec exactement le même nom mais voici les liens vers les protocoles qui sont plus proches (je pense).

http://www.mscience.com.au/upload/pages/nugen/nugen_ov_rna_seq-brochure.pdf

http://excilone.com/client/document/ug-arcturusE%E2%80%9E%C2%A2-riboamp%C3%82-hs-plus-amplification-kit-user-guide_38.pdf


  1. Oui, c'était étrange qu'ils disent ça. Le deuxième protocole avec la méthode basée sur polyA avait cependant un autre objectif, qui était « d'examiner la reproductibilité des gènes à période régulée dans un contexte génétique indépendant ». Je soupçonnerais que c'était son objectif principal, et pas tellement de regarder le biais de fragment, ce qui a déjà été fait dans d'autres articles. Ils n'ont même pas publié ces données dans le journal principal, ils les ont mises dans le supplément.

  2. Oui, cela supprimerait toute transcription sans queue polyA.

  3. Une façon de purifier consiste à utiliser des oligos antisens spécifiquement à l'ARNr. Les oligos seront attachés à une phase solide, sur une colonne ou une bille ou quelque chose, et l'ARNr s'y collera et tout ce qui ne l'est pas restera dans votre échantillon

  4. Il n'est pas prudent de dire que vous perdez des informations avec les kits à base de polyA. La technique basée sur polyA avait des lectures à une seule extrémité et seulement 75 pb de long. Ceci est comparé à l'autre protocole qui était apparié à 100 pb. Les lectures de 75 pb s'aligneront beaucoup plus facilement que 200 pb (100 x 2 depuis son appariement). Cependant, il n'y aura pas autant de certitude dans les alignements, car il y a une plus grande chance qu'il s'aligne à plusieurs endroits dans le génome, ou s'aligne au mauvais endroit. Alors oui, ils ont plus de lectures alignées, mais j'hésiterais à tirer des conclusions de cela. Et si vous regardez le nombre total de lectures, la méthode non-polyA s'aligne davantage. Encore une fois, je ne pense pas que le but principal était de montrer qu'une méthode est meilleure qu'une autre.

Fondamentalement, la méthode que vous choisissez dépend de votre expérience et de vos échantillons. Les hexamères aléatoires vous donneront de l'ARN non codant, ce qui est important dans certaines expériences, et c'est son principal avantage. Il donnera également une couverture plus uniforme à travers le gène (pas de biais 3'). La sélection Poly(A) ne vous donnera que l'ARNm, mais vous manquerez tous les transcrits dégradés ou partiellement dégradés. Si vous disposez d'un échantillon de haute qualité ou d'une grande quantité de matière première, c'est moins préoccupant. Comme mentionné précédemment, vous vous retrouvez avec des parties manquantes de l'extrémité 5' sur certaines transcriptions avec cette méthode. Si vous essayez de trouver une transcription de faible abondance, la sélection polyA est probablement la meilleure, car elle est plus susceptible d'être capturée et vous capturerez le tout, plutôt que d'en obtenir des morceaux avec des hexamères aléatoires. Ils ont tous les deux des avantages et des inconvénients. Espérons que cela vous aide ou aide quelqu'un à prendre une décision.


Voir la vidéo: Poly Adenylation of eukaryotic mRNA (Février 2023).