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6.5 : Réaction en chaîne par polymérase (PCR) - Biologie

6.5 : Réaction en chaîne par polymérase (PCR) - Biologie


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La réplication de l'ADN est accomplie par l'enzyme ADN polymérase qui a les caractéristiques suivantes :

  1. L'ADN polymérase catalyse l'extension d'un oligonucléotide dans le sens 5'→3'. Il ne peut pas aller dans la direction opposée.
  2. UNE modèle d'ADN (c'est-à-dire un oligonucléotide simple brin) est requis. Ce sont les informations qui sont répliquées (via l'appariement de base Watson-Crick). Si vous souhaitez répliquer le brin "sens" d'un duplex d'ADN, alors la matrice est le brin anti-sens. Puisque l'ADN est un duplex, maintenu ensemble par des forces non covalentes, nous pouvons séparer les brins du duplex (et obtenir une matrice appropriée) par dénaturation thermique (ou alcaline).
  3. L'ADN polymérase ne peut étendre qu'une oligonucléotide existant, il ne peut pas lancer la réplication. Ainsi, en plus d'une matrice, l'ADN polymérase nécessite un oligonucléotide amorce. L'ADN polymérase étend l'amorce dans le 5'3' orientation.
  4. Les nucléotides incorporés dans l'oligonucléotide naissant doivent être nucléosides triphosphates (c'est-à-dire les dNTP). L'énergie libérée lors de l'hydrolyse des liaisons phosphate anhydride est utilisée dans la formation de liaisons covalentes (incorporation de l'a-phosphate dans le squelette phosphodiester de l'oligonucléotide en croissance)
  5. Bien que les ADN polymérases catalysent l'extension dans le 5'3' direction, certains ont la capacité de "relire". La "relecture" est la capacité de reconnaître une mauvaise incorporation d'une base, et la capacité de sauvegarder et d'exciser la base incorrecte, puis de continuer.

Figure 6.5.1 : synthèse d'ADN

  • La PCR est un in vitro technique d'amplification d'une région de l'ADN qui se trouve entre deux régions de séquence connue.
  • L'amplification par PCR est réalisée en utilisant des amorces oligonucléotidiques. Il s'agit généralement d'oligonucléotides simples brins courts qui sont complémentaire aux régions extérieures de séquence connue.

Figure 6.5.2 : Amplification PCR

Les oligonucléotides servent de amorces pour l'ADN polymérase et chacun des brins dénaturés du duplex d'ADN parental sert de modèle.

Il en résulte la synthèse de nouveaux brins d'ADN qui sont complémentaires des brins matrices parents.

Les étapes de :

  1. Dénaturation du modèle
  2. Recuit d'apprêt
  3. Rallonge d'apprêt

comprendre un seul "cycle" dans la méthodologie d'amplification PCR.

  • Après chaque cycle, les brins d'ADN nouvellement synthétisés peuvent servir de modèles dans le cycle suivant (les amorces PCR sont généralement ajoutées en excès molaire substantiel à l'ADN matrice)

Résumé des produits à la fin de chaque cycle de PCR :

Figure 6.5.3 : Produits PCR

Le produit PCR souhaité sera un duplex du fragment de longueur définie. La question est : combien seront produits ?

· L'attendu amplification du produit de longueur définie souhaité par rapport à la concentration modèle d'origine « x » peut ainsi être représenté par la formule :

[(2m - (n + 1)) - (n + 1)] x

ou

(2m - 2(n+1))

(ceci est souvent abrégé en une simple règle empirique pour le amplification: (2m - 2n) x)

· L'interprétation de cette formule est que

  • Pour un nombre donné de cycles 'n' on fait '2m X' total des duplex possibles
  • Pour un nombre de cycles donné, il y aura '2(n+1) (ou 2n dans notre approximation) x' duplex qui sont formés soit à partir du modèle original, soit d'un fragment de longueur indéterminée, avec un fragment de longueur définie ( et représentent un produit indésirable)
  • Ainsi, la concentration totale de produit recherché (duplex de longueur définie par les amorces PCR) sera
    (2m - 2(n+1)) x (où x est la concentration du duplex original)

La valeur d'amplification théorique n'est jamais atteinte en pratique. Plusieurs facteurs empêchent cela de se produire, notamment :

1. Compétition de brins filles complémentaires avec des amorces pour le réhybridation (c'est-à-dire que le réhybridation de deux brins filles n'entraîne aucune amplification).

2. Perte d'activité enzymatique due à la dénaturation thermique, en particulier dans les derniers cycles

3. Même sans dénaturation thermique, la quantité d'enzyme devient limitante en raison de l'excès de cible molaire dans les cycles ultérieurs (c'est-à-dire après 25 à 30 cycles, trop d'amorces doivent être prolongées)

4. Recuit possible de l'amorce du deuxième site et amorçage non productif

Paramètres de cyclage thermique

Les paramètres de cyclage thermique sont essentiels à une expérience PCR réussie. Les étapes importantes de chaque cycle de PCR comprennent :

1. dénaturation du modèle (généralement effectuée à la température la plus élevée - 100 ° C)

2. recuit des amorces (la température est choisie en fonction de la température de fusion de l'amorce)

3. extension des amorces (réalisée de manière optimale pour la polymérase utilisée)

Un profil de température représentatif pour chaque cycle pourrait ressembler à ce qui suit :

Figure 6.5.4 : Cyclisme thermique

Tampons et MgCl2 dans les réactions PCR

Un tampon de réaction typique pour la PCR serait quelque chose comme :

  • Tris 10 mM, pH 8,3
  • 50 mM de KCl
  • 1,5 mM de MgCl2
  • 0,01 % de gélatine
  • Le MgCl2 la concentration dans le mélange réactionnel final est généralement comprise entre 0,5 et 5,0 mM, et la concentration optimale est déterminée empiriquement (typiquement entre 1,0 et 1,5 mM). mg2+ ions:
    • forment un complexe soluble avec les dNTP qui est essentiel pour l'incorporation des dNTP
    • stimuler l'activité de la polymérase
    • augmenter la Tm (température de fusion) de l'interaction amorce/matrice (c'est-à-dire qu'elle sert à stabiliser l'interaction duplex

Généralement,

  • meugler mg2+ conduit à de faibles rendements (ou aucun rendement) et
  • haute mg2+ conduit à l'accumulation de produits non spécifiques (mauvais amorçage).

Choix des polymérases pour la PCR

  • L'une des avancées importantes qui ont permis le développement de la PCR a été la disponibilité de polymérases thermostables.
  • Cela a permis à l'enzyme initialement ajoutée de survivre à des cycles de température approchant 100 °C.
  • Propriétés des ADN polymérases utilisées en PCR

Taq/Amplitaq®

Évent™

Ventilation profonde™

Pfu

Je

ULTma

95 °C demi-vie

40 minutes

400 minutes

1380 minutes

>120 minutes

20 min

>50 minutes

Taux d'extension (nt/sec)

75

>80

?

60

>33

?

Fins résultantes

3' A

> 95% émoussé

> 95% émoussé

cru

3' A

cru

Déplacement de brin

+

+

5'®3' exo

+

+

3'®5' exo

+

+

+

+

Amorces

Conception d'amorce

  • Généralement, les amorces utilisées ont une longueur de 20 à 30 mers. Ceci fournit des températures de recuit pratiques (du régime à haute température où la polymérase thermostable est la plus active).
  • Les amorces doivent éviter les étirements de séquences de polybases (par exemple, poly dG) ou les motifs répétés - ceux-ci peuvent s'hybrider avec un registre inapproprié sur le modèle.
  • Les séquences répétées inversées doivent être évitées afin d'empêcher la formation d'une structure secondaire dans l'amorce, ce qui empêcherait l'hybridation à la matrice.
  • Les séquences complémentaires d'autres amorces utilisées dans la PCR doivent être évitées afin d'éviter l'hybridation entre les amorces (particulièrement importante pour la 3' fin de l'amorce)
  • Si possible, l'extrémité 3' de l'amorce doit être riche en bases G, C pour améliorer l'hybridation de l'extrémité qui sera étendue
  • La distance entre les amorces doit être inférieure à 10 Kb. Typiquement, une réduction substantielle du rendement est observée lorsque les amorces s'étendent les unes des autres au-delà de ~ 3 Kb.

Température de fusion (Tm) des amorces

  • La Tm d'hybridation des amorces peut être calculée en utilisant diverses formules. La formule la plus couramment utilisée est :

(1) Tm = [(nombre de résidus A+T) x 2 °C] + [(nombre de résidus G+C) x 4 °C]

  • Exemples de Tm calculs

g

UNE

T

C

Tm

15 mers

3

5

2

5

46

20 mers

6

5

4

5

62

30 mers

8

6

8

8

92

Si la température de recuit est trop élevée, les amorces ne se recueilleront pas. S'il est trop bas, erreur d'amorçage peut se produire sur des sites de séquence d'ADN similaire au site de liaison d'amorce prévu

Analyse de l'expérience PCR

  • 25-30 cycles sont communs
  • Le produit principal doit être une molécule d'ADN duplex dont les extrémités 5' et 3' sont définies par les deux amorces PCR
  • D'autres produits peuvent cependant être fabriqués. Ceux-ci représenteront souvent des produits de sites d'amorçage secondaires (mauvais amorçage) ou des erreurs de mauvaise incorporation de la polymérase
  • Ainsi, le produit PCR peut être hétérogène et doit être séparé et analysé
  • Agarose électrophorèse sur gel, en combinaison avec la coloration au bromure d'éthidium, est la méthode la plus courante pour séparer et analyser les produits PCR

Amplification des acides nucléiques

Réaction en chaîne par polymérase multiplex

Dans la PCR multiplex, deux ensembles d'amorces ou plus conçus pour l'amplification de différentes cibles sont inclus dans la même réaction PCR. En utilisant cette technique, plus d'une séquence cible dans un échantillon clinique peut être amplifiée dans un seul tube. Dans le prolongement de l'utilisation pratique de la PCR, cette technique peut économiser du temps et des efforts. Les amorces utilisées dans les réactions multiplex doivent être sélectionnées avec soin pour avoir des températures de recuit similaires et ne doivent pas être complémentaires les unes des autres. Les tailles d'amplicon doivent être suffisamment différentes pour former des bandes distinctes lorsqu'elles sont visualisées par électrophorèse sur gel. La PCR multiplex peut être conçue dans une réaction PCR à modèle unique qui utilise plusieurs ensembles d'amorces pour amplifier des régions spécifiques dans une matrice, ou une réaction PCR à modèles multiples, qui utilise plusieurs modèles et plusieurs ensembles d'amorces dans le même tube de réaction (Fig. 9.6 ). Bien que l'utilisation de la PCR multiplex puisse réduire les coûts et le temps pour détecter simultanément deux, trois ou plusieurs agents pathogènes dans un échantillon, la PCR multiplex est plus compliquée à développer et est souvent moins sensible que la PCR à amorce unique. L'avantage de la PCR multiplex est qu'un jeu d'amorces peut être utilisé comme contrôle interne, ce qui nous permet d'éliminer la possibilité de faux positifs ou négatifs. De plus, la PCR multiplex peut économiser une polymérase et un modèle coûteux en nombre insuffisant.

9.6. Présentation de la PCR multiplex.


Pourquoi Taq est-il utilisé en PCR ?

Taq polymérase est une forme thermostable de ADN polymérase qui peut fonctionner après une exposition aux températures élevées nécessaires à la PCR. Autres polymérases soumis à des températures élevées utilisé dans le réaction en chaîne par polymérase (PCR) se dénaturerait et deviendrait non fonctionnel.

On peut également se demander pourquoi la découverte de la Taq ADN polymérase a-t-elle été importante pour le développement de la PCR ? Taq polymérase, le premier thermostable ADN polymérase pour PCR, était découvert en 1966. PCR transformé ADN amplification, rendant le processus rapide et efficace. Cela révolutionnerait le clonage, ADN les tests, la médecine légale et la conception de médicaments.

Alors, pourquoi Thermus aquaticus est-il utilisé en PCR ?

C'est à cause de cette propriété qui fait de la Taq polymérase un produit si important. L'ADN polymérase trouvée dans Thermus aquatique reste stable même à des températures très élevées. En raison de cette stabilité, il peut être utilisé dans le processus connu sous le nom de réaction en chaîne par polymérase, ou PCR.


Dans les sciences biologiques, des avancées technologiques ont catapulté la discipline dans l'âge d'or de la découverte. Par exemple, le domaine de la microbiologie a été transformé avec l'avènement du microscope d'Anton van Leeuwenhoek, qui a permis aux scientifiques de visualiser pour la première fois les procaryotes. Le développement de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est l'une de ces innovations qui ont changé le cours de la science moléculaire avec son impact couvrant d'innombrables sous-disciplines de la biologie. Le processus théorique a été décrit par Keppe et ses collègues en 1971. Cependant, il a fallu encore 14 ans avant que la procédure PCR complète ne soit décrite et appliquée expérimentalement par Kary Mullis alors qu'il travaillait chez Cetus Corporation en 1985. L'automatisation et le raffinement de cette technique ont progressé avec l'introduction d'un ADN polymérase thermostable de la bactérie Thermus aquatique, par conséquent le nom Taq ADN polymérase.

La PCR est une technique d'amplification puissante qui peut générer un approvisionnement suffisant d'un segment spécifique d'ADN (c'est-à-dire un amplicon) à partir d'une petite quantité seulement de matériel de départ (c'est-à-dire une matrice d'ADN ou une séquence cible). Bien que simples et généralement sans problème, il existe des pièges qui compliquent la réaction et produisent des résultats erronés. Lorsque la PCR échoue, cela peut conduire à de nombreux produits d'ADN non spécifiques de tailles variables qui apparaissent sous la forme d'une échelle ou d'un frottis de bandes sur des gels d'agarose. Parfois, aucun produit ne se forme. Un autre problème potentiel survient lorsque des mutations sont involontairement introduites dans les amplicons, ce qui entraîne une population hétérogène de produits PCR. Les échecs de PCR peuvent devenir frustrants à moins que la patience et un dépannage minutieux ne soient utilisés pour trier et résoudre le(s) problème(s). Ce protocole décrit les principes de base de la PCR, fournit une méthodologie qui se traduira par l'amplification de la plupart des séquences cibles et présente des stratégies pour optimiser une réaction. En suivant ce guide PCR, les étudiants devraient être capables de :

  • Mettre en place des réactions et des conditions de cyclage thermique pour une expérience PCR conventionnelle
  • Comprendre la fonction de divers composants de la réaction et leur effet global sur une expérience PCR
  • Concevoir et optimiser une expérience PCR pour n'importe quel modèle d'ADN
  • Résoudre les échecs des expériences de PCR

Amélioration de la spécificité de la réaction en chaîne de la polymérase par l'oxyde de graphène par modification de surface : le polymère zwitterionique est supérieur aux autres polymères avec des charges différentes

1 Département des biomatériaux, Collège des matériaux, 2 Laboratoire clé d'État de biologie du stress cellulaire, École des sciences de la vie, 3 Département de physique, Institut de recherche sur le biomimétisme et la matière molle, Université de Xiamen, Xiamen, République populaire de Chine

*Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale

Résumé: Des oxydes de graphène (GO) avec différentes caractéristiques de surface, telles que la taille, le degré de réduction et la charge, sont préparés, et leurs effets sur la spécificité de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont étudiés. Dans cette étude, nous démontrons que le GO avec une grande taille et un degré de réduction élevé est supérieur au GO petit et non réduit pour améliorer la spécificité de la PCR. L'acide polyacrylique chargé négativement (PAA), le polyacrylamide chargé positivement (PAM), le polyéthylène glycol neutre (PEG) et le polymère zwitterionique poly(sulfobétaïne) (pSB) sont utilisés pour modifier le GO. La capacité d'amélioration de la spécificité de la PCR augmente dans l'ordre suivant : GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Ainsi, le GO modifié par un polymère zwitterionique est supérieur aux autres dérivés de GO avec des charges différentes pour améliorer la spécificité de la PCR. Les dérivés GO sont également utilisés avec succès pour améliorer la spécificité de la PCR pour l'amplification de l'ADN mitochondrial humain en utilisant l'ADN génomique du sang comme matrice. Des simulations de dynamique moléculaire et un amarrage moléculaire sont effectués pour élucider l'interaction entre les polymères et Pfu ADN polymérase. Nos données démontrent que la taille, le degré de réduction et la charge de surface de GO affectent la spécificité de la PCR. Sur la base de nos résultats, le GO modifié par polymère zwitterionique peut être utilisé comme additif efficace pour améliorer la spécificité de la PCR.

Mots clés: Additif PCR, charge, pSB, Pfu ADN polymérase

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est l'un des outils les plus répandus et les mieux développés en biologie moléculaire. 1,2 En raison de sa capacité à produire des milliards de copies d'ADN par amplification rapide et sélective d'une région spécifique de la chaîne d'ADN, il a un large éventail d'applications dans l'amplification génique, le clonage moléculaire et le diagnostic de maladies. 3 Une PCR basique nécessite généralement les cinq composants suivants : 1) matrice d'ADN contenant la région d'ADN cible, 2) deux amorces pour initier la synthèse d'ADN, 3) une ADN polymérase thermostable pour catalyser la synthèse d'ADN, 4) des désoxynucléosides triphosphates (dNTP, le blocs de nouveau brin d'ADN) et 5) un tampon comprenant des cations bivalents (généralement Mg 2 & 43 ). 4 Souvent, un processus d'optimisation fastidieux peut être nécessaire pour obtenir une PCR réussie, principalement lorsqu'une amplification à partir de l'ADN génomique est requise.

De nombreux facteurs affecteront la spécificité de la PCR, tels que la pureté et la séquence de l'amorce, la pureté de l'ADN matrice, la concentration en Mg 2 & 43, la température de recuit et d'autres additifs tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), qui sont fréquemment inclus dans le mélange PCR . 5,6 Habituellement, lorsque la concentration de matrice d'ADN est très faible ou que la structure de la matrice d'ADN est très compliquée, comme un gène riche en GC ou un ADN génomique de mammifère, la spécificité de la PCR peut être très faible. Différentes stratégies ont été développées pour améliorer la spécificité de la PCR, telles que la PCR nichée utilisant deux ensembles d'amorces distincts, la PCR de toucher avec des températures de recuit progressivement réduites et la PCR de démarrage à chaud retenant l'ADN polymérase ou les amorces jusqu'à ce que le mélange réactionnel ait atteint une température supérieure à le seuil de liaison non spécifique de l'amorce à la matrice. 4 Cependant, l'optimisation de la conception de l'amorce, des conditions de cycle PCR et des températures de recuit et l'ajustement des concentrations des composants PCR sont des processus longs et frustrants. Pour améliorer la spécificité de la PCR, plusieurs petites molécules ont été utilisées comme additifs, telles que le DMSO, la glycérine, la bétaïne, le formamide et la sérumalbumine bovine (BSA). 7,8 Les utiliser seuls ou en combinaison ne garantit pas l'amélioration de la spécificité de la PCR. Ainsi, l'effet de ces additifs est imprévisible. Par conséquent, il reste un défi de trouver de nouveaux additifs pour améliorer la spécificité de la PCR.

Ces dernières années, des nanomatériaux ont été utilisés dans les systèmes PCR, notamment des nanoparticules métalliques, des points quantiques semi-conducteurs, des nanomatériaux de carbone et des nanoparticules de polymère. 9󈝿 Les nanomatériaux possèdent souvent des propriétés physiques et chimiques uniques, par exemple un effet de surface résultant de leur rapport surface/volume élevé, qui diffère grandement des matériaux macroscopiques. L'effet des nanomatériaux sur la PCR dépend principalement de la forte interaction entre les composants de la PCR et les nanomatériaux. 20 Cependant, des résultats contradictoires ont été obtenus de différents groupes de recherche. Par conséquent, l'effet des nanomatériaux avec des caractéristiques de surface différentes sur la PCR n'est pas encore clair et des investigations beaucoup plus systémiques et approfondies sont nécessaires pour comprendre le mécanisme correspondant.

Notre étude précédente a démontré que l'oxyde de graphène réduit (RGO) peut améliorer considérablement la spécificité de la PCR. 19 Cependant, RGO a une faible solubilité dans l'eau en raison de son manque de groupes fonctionnels à sa surface, ce qui inhibe l'application ultérieure de RGO. En comparaison avec RGO, il existe de nombreux groupes hydroxyle, époxy et carboxyle sur la feuille d'oxyde de graphène (GO), ce qui entraîne une polarité et une hydrophilie élevées de GO.Ainsi, GO est hydrophile et peut être bien dispersé dans l'eau. Une modification de surface supplémentaire de GO peut fournir à GO de nouvelles propriétés de surface. Dans cette étude, GO a été modifié avec de l'acide polyacrylique à terminaison carboxyle chargé négativement, du polyacrylamide à terminaison aminée chargé positivement (PAM), du polyéthylène glycol neutre (PEG) ou du polymère zwitterionique poly(sulfobétaïne) (pSB). De plus, nous avons étudié l'effet de GO avec différentes propriétés de surface, telles que la taille, le degré de réduction et la modification de surface, sur la spécificité de la PCR. Nous avons constaté que les grands et RGO étaient supérieurs aux petits et aux non-RGO pour améliorer la spécificité de la PCR. La charge superficielle de GO a également affecté la spécificité de la PCR dans l'ordre suivant : GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Pour le GO modifié par un polymère, le pSB zwitterionique s'est avéré supérieur pour améliorer la spécificité de la PCR par rapport aux polymères neutres et chargés négativement et positivement. Ces dérivés GO avec différentes charges de surface ont été utilisés avec succès comme additifs dans l'amplification de l'ADN mitochondrial en utilisant l'ADN génomique sanguin comme matrice. Sur la base de nos résultats, nous suggérons que les dérivés de GO peuvent également améliorer la spécificité de la PCR d'ADN de faible abondance obtenu à partir d'échantillons cliniques. Les simulations de dynamique moléculaire et l'amarrage moléculaire sont également utilisés pour étudier l'interaction entre les polymères et Pfu ADN polymérase pour comprendre le mécanisme d'amélioration de la spécificité. Les résultats de nos recherches pourraient à terme faire progresser l'application de la GO dans les domaines biomédicaux.

La poudre de graphite naturel (320 mesh, Alfa, 99%) a été achetée auprès de Tianjin Guangfu Chemical Agent Co., Ltd. (Tianjin, République populaire de Chine). NaNO3, KMnO4, K3Bon de commande4 (99%), L-lysine (98 & ​​37), ninhydrine (97 & 37) et H2O2 ont été achetés auprès de Guoyao Co., Ltd. (Shanghai, République populaire de Chine). Acide acrylique (AA), acrylamide (AM), H2DONC4, HCl, hydrate d'hydrazine (80 & 37), éthanol, NaHCO3, NaOH, Mg2DONC4 (99%), le rouge de méthyle et le borate de sodium ont été achetés auprès de Xilong Chemical (Guangzhou, République populaire de Chine). Le peroxosulfate de potassium a été acheté auprès de Dahao Nanhong Industrial Co., Ltd. (Shantou, République populaire de Chine). mPEG-NH2 a été acheté à Kaizheng Biotech Development Co., Ltd. (Pékin, République populaire de Chine). Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl]carbodiimide (EDC, 98%) a été acheté auprès d'Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, République populaire de Chine). Le BSA (98&37) et l'hydroxyde de [2-(méthacryloyloxy)éthyl]diméthyl-(3-sulfopropyl)ammonium (SB, 98&37) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Tous les réactifs utilisés étaient de qualité analytique, sauf mention spéciale. La tubulure de dialyse (8 000 – MWCO) a été achetée auprès de Solarbio Life Sciences (Pékin, République populaire de Chine). L'ADN plasmidique pET-32a a été acheté auprès de Novegan, Shanghai, République populaire de Chine. Les Pfu polymérase, dNTP, tampon 10&# 215, filtre 0,22 μm, agarose, glycérol, bouillon Luria-Bertani, bromure d'éthidium (EB), marqueur ADN, tampon de chargement d'ADN, CaCl anhydre2, des tubes PCR, du tampon TAE 50&# et de l'ampicilline ont été achetés auprès de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, République populaire de Chine). Les amorces ont été synthétisées par Sangon Biotech Co., Ltd. (tableau SI). Les produits de PCR ont été séquencés par Sangon Biotech Co., Ltd. Le kit Mini Plasmid a été acheté auprès de TIANGEN Biotech Co., Ltd. (Pékin, République populaire de Chine). Le kit de préparation de matrice PCR High Pure a été acheté auprès de Roche Ltd. (Allemagne). De l'eau déminéralisée a été utilisée dans toutes les expériences.

Synthèse de GO et de ses dérivés

GO a été synthétisé selon notre méthode précédente. 32,33 Premièrement, 2,0 g de poudre de graphite et 1,0 g de NaNO3 ont été ajoutés à 46 mL de 98 & 37 H2DONC4 dans un bain de glace, puis 6,0 g de KMnO4 a été ajouté lentement au mélange sous agitation vigoureuse. Le mélange a été agité en continu pendant 2 heures dans le bain de glace et placé dans un bain-marie à 35°C pendant 30 minutes. Ensuite, 92 ml d'eau ont été ajoutés progressivement et la température a été élevée à 95°C. La solution a été agitée pendant 3 heures. Enfin, 400 ml d'eau ont été ajoutés, et 6 ml de 30 & 37 H2O2 est tombé dans la réaction. Après refroidissement à température ambiante, le mélange a été filtré et lavé avec HCl 1:10 (rapport en volume), suivi par des lavages répétés avec de l'eau pour éliminer l'acide. Le gâteau de filtration a ensuite été dispersé dans de l'eau pour obtenir de l'oxyde de graphite. L'exfoliation de l'oxyde de graphite en GO a été réalisée par ultrasonication pendant 3 heures à 500 W. L'agrégat a été éliminé par centrifugation à 4 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant a été recueilli et dialysé dans de l'eau pendant 1 semaine pour éliminer les sels résiduels.

Le petit GO (S-GO) et le grand GO (L-GO) ont été préparés selon la littérature. 34 La solution de GO dialysée a été soniquée pendant 10 heures, suivie d'une centrifugation à 12 000 tr/min pendant 20 minutes. Le surnageant a été collecté sous forme de S-GO. L'agrégat a été à nouveau dispersé dans de l'eau et centrifugé à 2 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant a été collecté sous forme de L-GO. Le RGO a été préparé à partir du GO, qui a été réduit par l'hydrate d'hydrazine dans l'ammoniac. Un total de 50 ml de 1 mg ml de 𕒵 GO a été chargé dans un ballon à quatre cols, puis 6 μL de 80% hydrate d'hydrazine et 100 μL de 28% hydroxyde d'ammonium ont été ajoutés. Après un mélange minutieux, la solution a été chauffée dans un bain d'huile à 95°C pendant 1 heure. Le surnageant a été récupéré et dialysé pendant une semaine dans l'eau. Un autre échantillon de RGO avec un degré de réduction plus élevé a été préparé en ajoutant 42 μL d'hydrate d'hydrazine 80% et 700 μL de 28% hydroxyde d'ammonium.

GO-PAA et GO-PAM ont été préparés selon notre protocole précédent. 35 Tout d'abord, 1 ml de 1 g ml de monomère 𕒵 AA a été ajouté à 50 ml de solution de 1 mg ml de 𕒵 GO sous agitation vigoureuse à température ambiante. Sous purge d'azote pendant 30 minutes, 80 mg de (NH4)2S2O8 a été ajouté et chauffé à 70°C pendant 3 heures dans un bain d'huile. Après refroidissement à température ambiante, 200 ml d'eau ont été ajoutés et soniqués pendant 1 heure, suivis d'une dialyse pendant une semaine pour éliminer le PAA libre. Après centrifugation à 4000 tr/min pendant 30 minutes, le surnageant a été collecté sous forme de GO-PAA. GO-PAM et GO-pSB ont été préparés de la même manière, sauf que le monomère AA a été remplacé par le monomère AM ou SB. Pour la préparation de GO-pSB, du peroxosulfate de potassium a été utilisé comme initiateur et le mélange réactionnel a été chauffé à 70°C pendant 15 heures.

GO-PEG a été préparé selon la littérature. 36 Tout d'abord, 10 ml de NaOH 3 M ont été mélangés avec 20 ml de solution de 𕒵 GO à 2 mg et soniqués pendant 3 heures. Ensuite, 10/37 HCl ont été ajoutés pour neutraliser la solution à pH 7. Le mélange a été filtré et rincé avec de l'eau. Le gâteau de filtration a ensuite été dispersé dans 40 ml d'eau. Un total de 80 mg de mPEG-NH2 a été ajouté à la solution et soniqué pendant 5 minutes. Ensuite, 20 mg d'EDC ont été ajoutés et soniqués pendant 30 minutes supplémentaires, suivis de l'ajout de 60 mg d'EDC et d'une agitation pendant la nuit. Le surnageant a été collecté et dialysé pendant une semaine dans de l'eau pour éliminer l'excès de mPEG-NH2. Après 30 minutes de centrifugation à 4000 rpm, le surnageant a été collecté sous forme de GO-PEG.

Caractérisation de GO et de ses dérivés

Des images de microscopie à force atomique (AFM) ont été obtenues en mode tapotement dans l'air en utilisant le Nanoscope Multimode 8 (Veeco Instruments Inc., USA). Les spectres d'absorption UV–vis ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre UV–Vis TU-1901 (Beijing Purkinje General Instrument, République populaire de Chine). Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (FTIR) ont été enregistrés sur un spectromètre Nicolet iS10 (Thermo Scientific, USA). Système de diffraction des rayons X sur poudre (XRD) (Ultima IV Rigaku, Japon) équipé de rayonnement Cu K&# 945 (λ ɣ.542 Å) a été utilisé pour caractériser les structures cristallographiques des matériaux. Les spectres de spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) ont été enregistrés sur un spectromètre photoélectronique à rayons X Phi Quantum 2000 (PHI, USA). L'analyse thermogravimétrique (TGA) a été réalisée sur un SDT-Q600 (TA Instruments, USA) sous atmosphère d'azote à une vitesse de chauffage de 10 ° 176 C min ° 87221. Les potentiels zêta ont été mesurés par un Malvern Nano-ZS (Malvern Instruments, Co., UK). Des titrages de Boehm 37 ont été effectués pour déterminer la teneur en groupes carboxyle et hydroxyle sur la surface RGO. L'affinité de liaison de Pfu polymérase avec GO et RGO a été étudiée par des calorimètres de titrage isotherme (NANO ITC TA Instruments) à 25 °C. Pfu la polymérase a été titrée avec GO et RGO de différentes teneurs en carboxyle (8,39 & 37, 7,28 & 37 et 5,43 & 37, respectivement). La cellule d'échantillon était remplie de 0,12 μg mL 𕒵 Pfu polymérase, et la cellule de référence a été remplie d'eau. Dans chaque expérience, 50 μL de 100 μg mL 𕒵 RGO ont été prélevés à l'aide d'une seringue et ajoutés à la cellule d'échantillon à intervalles égaux de 200 secondes. Les changements de chaleur ont été mesurés après chaque addition. Données calorimétriques pour le graphène–Pfu la liaison à la polymérase a été analysée à l'aide du logiciel NanoAnalyze pour NANO ITC.

PCR et électrophorèse sur gel d'agarose

Le plasmide pET-32a a été utilisé comme matrice de PCR. Les composants suivants ont été mélangés lors du premier cycle de PCR : 1 tampon PCR contenant 2 mM de Mg 2 43, dNTP (chacun 0,2 mM), amorce F1 (0,4 956M), amorce R1 (0,4 956M) ( Tableau S1), ADN plasmidique (0,5 ng μL 𕒵 ) et Pfu polymérase (0,1 U μL 𕒵 ). GO ou ses dérivés avec différentes concentrations ont été ajoutés dans le système PCR. Chaque échantillon a été complété jusqu'au volume final de 25 μL avec de l'eau. Dans la PCR de second tour, la même condition de réaction a été définie, sauf que 0,5 μL de produit de PCR a été utilisé pour remplacer l'ADN plasmidique comme matrice. Les conditions de PCR sont décrites dans le tableau S2.

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'université de Xiamen. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires sains qui ont fourni un consentement éclairé écrit. L'ADN génomique humain a été isolé en utilisant le kit de préparation de matrice PCR High Pure. Un total de 20 ng d'ADN μL 𕒵 a été ajouté à la place de l'ADN plasmidique. Les amorces F2 et R2 (tableau S1) ont été utilisées pour amplifier un fragment d'ADN mitochondrial humain. Les composants de la PCR étaient les mêmes que ci-dessus, sauf que l'ADN plasmidique a été remplacé par 2,5 μL d'ADN génomique. Dans la PCR du deuxième ou du troisième tour, 2,5 μL de produit de PCR du dernier tour ont été utilisés comme matrice au lieu de l'ADN génomique. Les conditions de PCR sont répertoriées dans le tableau S2. Les PCR ont été réalisées dans un thermocycleur T3 (Biometra, Allemagne). Les produits de PCR ont été soumis à une électrophorèse dans un gel d'agarose 1,5 & 37 pendant 30 minutes, colorés avec 0,5 956 g mL # 87221 EB et analysés à l'aide d'un système Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). L'intensité de fluorescence de la bande de produit PCR a été analysée avec le module d'analyse de densité optique du logiciel Image Lab.

Simulation in silico de Pfu interaction polymérase–polymère

Des simulations de dynamique moléculaire et un amarrage moléculaire ont été utilisés pour étudier l'interaction possible entre les polymères et Pfu polymérase. Des formes ionisées de PAA, PAM et pSB ont été utilisées dans tous les amarrages et simulations (Figure S1). Les simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées à l'aide de la Groningen Machine for Chemical Simulation (GROMACS 5.0.4). 38 Le champ de force CHARMM36 39 a été utilisé pour l'ADN polymérase et l'eau de charge ponctuelle simple pour le solvant. Chaque polymère & complexe protéique a été placé dans une boîte de simulation (14 & 21514 & 21514 nm) et rempli de solvant. PAA et PAM ont des frais nets de 󔽎e et 70e, respectivement. Le PEG et le pSB sont neutres. Pfu la polymérase a une charge nette de 𕒸e. Des ions Na + et Cl − ont été ajoutés pour neutraliser les charges nettes du système. Dans chaque simulation indépendante, le polymère a été placé à un emplacement aléatoire autour de la protéine. Avant la dynamique, la structure a été relâchée par minimisation d'énergie en utilisant l'algorithme de descente la plus raide. Pour équilibrer le système, une simulation 100 ps NVT, suivie d'une simulation 100 ps NPT, a été réalisée. La température du système a été maintenue à 345 K (72 °C), qui est la température d'allongement pour Pfu polymérase. Les interactions électrostatiques ont été traitées en utilisant la méthode Smooth Particle Mesh Ewald. Toutes les liaisons dans les molécules simulées ont été contraintes à leurs valeurs de référence avec Linear Constraint Solver. Les énergies de Coul Short Range ont été calculées après avoir atteint l'équilibration.

Afin de calculer les sites actifs possibles dans l'ADN polymérase, le Site Finder a été réalisé par Molecular Operating Environment (2012.10). 40 Le but de la simulation d'amarrage est de calculer et de noter les interactions entre les ligands et Pfu polymérase en utilisant le logiciel AutoDockVina 1.1.2 avec ses paramètres de champ de force par défaut. 41 Cinq simulations d'amarrage indépendantes, chacune avec 10 sites de Pfu polymérase pour essai, ont été réalisées pour chaque système polymère/protéine.

Préparation et caractérisation du GO et de ses dérivés

La figure 1 montre la préparation de S-GO, L-GO, GO-PAA, GO-PEG, GO-PAM et GO-pSB. GO a été synthétisé à partir du graphite naturel en utilisant la méthode de Hummers modifiée. 32,33 S-GO et L-GO ont été préparés avec la technologie de centrifugation à grande vitesse. Les images AFM ont montré que la taille moyenne de S-GO (50 nm) était beaucoup plus petite que celle de L-GO (500 nm), tandis que l'épaisseur était de Ӭ.9 nm pour les deux échantillons (Figure S2). Le résultat montre que S-GO et L-GO sont des feuilles monocouches de même épaisseur. 42 Ainsi, nous pouvons exclure l'effet de l'épaisseur de GO sur la spécificité de la PCR dans ces dernières expériences. Le greffage de polymère sur la surface de GO a entraîné une augmentation de l'épaisseur jusqu'à 1 82113 nm (figure S2C 8211F). Les titrages de Boehm ont montré que la quantité de groupes carboxyle de S-GO et L-GO était de 9,01% et 8,17%, respectivement. S-GO avait plus de groupes carboxyle en raison d'un rapport surface/volume plus important. Le potentiel zêta de S-GO (󔼵.1۪.6 mV) était inférieur à celui de L-GO (󔼫.6۪.8 mV), ce qui signifie que la teneur en groupes carboxyle de S-GO est supérieure à celle de L-GO, et le résultat est cohérent avec les résultats des titrages Boehm.

Figure 1 Préparation du GO et de ses dérivés.
Remarques: (UNE) Préparation de S-GO et L-GO. (B) Préparation de quatre dérivés GO. Les photographies montrent la couleur de différents GO et dérivés de GO dans l'eau. (C) Formules moléculaires de PAA, PAM, PEG et pSB.
Abréviations : EDC, chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide GOs, oxydes de graphène L-GO, grand GO PAA, acide polyacrylique PAM, polyacrylamide PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne) S-GO, petit GO.

GO-PAA, GO-PAM et GO-pSB ont été préparés par polymérisation radicalaire de monomères AA, AM et SB sur la surface GO, respectivement. D'autre part, mPEG-NH2 a été conjugué aux groupes carboxyle sur GO via la formation d'amide catalysée par le carbodiimide. Les spectres ultraviolets & 8211visibles (UV & 8211vis) (figure S3), les spectres FTIR (figure S4), les spectres XRD (figure S5) et les spectres XPS (figure S6) ont été utilisés pour caractériser tous les échantillons et répertoriés dans les matériaux supplémentaires. Toutes ces caractérisations ont indiqué que PAA, PAM, PEG et pSB ont été greffés avec succès sur GO. La TGA de GO, GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG et GO-pSB est illustrée à la figure S7. Le TGA de GO avec une teneur en carboxyle de 8,39 & 37 présente deux régions de perte de masse. La première perte de poids à température °C est attribuée à la perte d'eau adsorbée. La deuxième perte de poids entre 180°C et 230°C est attribuée à la décomposition des groupes fonctionnels contenant de l'oxygène, tels que les groupes carboxyle, époxyde et hydroxyle, dans GO. La perte de poids du graphène diminue avec la diminution de la teneur en carboxyle (figure S7A). Par rapport au GO, la deuxième perte de poids des dérivés du GO se produit à une température plus élevée, ce qui résulte principalement de la décomposition de la chaîne polymérique. En calculant le pourcentage de perte de poids, les teneurs calculées en PAA, PAM, PEG et pSB étaient respectivement de 43,48&37, 40,96&37, 42,53&37 et 38,70&37 (tableau S3). Ces GO modifiés par polymère ont une teneur similaire en polymère. Ainsi, nous pouvons exclure les effets de la teneur en polymère sur la spécificité de la PCR dans ces dernières expériences.

Les potentiels zêta de GO et RGO étaient respectivement de 󔼯.1۪,5 mV et 󔼗,6۪.3 mV, indiquant que GO était plus stable que RGO. Après avoir greffé des polymères à la surface du GO, le potentiel zêta du GO-PAA (󔼶.9۪.9 mV) est devenu plus négatif en raison de la charge négative du COO − dans le PAA. Le potentiel zêta de GO-PAM a augmenté à 󔼠.1۫.2 mV en raison du NH chargé positivement3 + dans PAM. Le potentiel négatif du GO-PEG (󔼫.7۪.8 mV) et du GO-pSB (󔼜.4۪.9 mV) résultait des groupes COO − sur la surface GO, même si le PEG était un polymère neutre et le pSB était un polymère zwitterionique (tableaux S4 et S5).

L'effet de la taille GO sur la PCR

Un processus courant de PCR comprend 25 cycles de changement de température répété. Un cycle PCR typique comprend les trois étapes suivantes : 1) dénaturation de l'ADN matrice, 2) hybridation de deux amorces synthétiques à l'ADN matrice et 3) extension des amorces liées catalysée par une ADN polymérase thermostable. 5 Bien que la PCR puisse multiplier le gène cible de manière exponentielle, l'amplification non spécifique reste un problème. En particulier dans la PCR à plusieurs tours, la matrice d'ADN initiale et les amorces n'ayant pas réagi perturbent la réaction et provoquent une accumulation de produits non spécifiques. 43 Dans les études initiales, nous avons utilisé le plasmide pET-32a comme matrice d'amplification PCR. La concentration de matrice optimale a été déterminée par des expériences de dilution en série (figure S8). Un total de 0,5 ng de plasmide μL 𕒵 a été considéré comme la concentration de matrice optimale dans la PCR de premier tour, et 0,5 μL du produit de PCR de premier tour était la concentration de matrice optimale dans la PCR de deuxième tour. L'effet de GO avec différentes tailles (S-GO et L-GO) sur les deux tours de PCR a été étudié. Dans la PCR de premier tour, l'intensité de la bande cible de 689 pb diminue avec l'augmentation de la concentration de GO, ce qui indique que la réaction est inhibée à la fois par S-GO et L-GO à haute concentration (4,8 μg mL 𕒵 pour S-GO et 6,4 μg mL 𕒵 pour L-GO Figure 2A–C). Dans la PCR de second tour, le produit de PCR de premier tour a été utilisé comme modèle.Étant donné que le produit PCR contient non seulement le produit cible, mais également la matrice d'ADN initiale n'ayant pas réagi, les amorces et les produits non spécifiques, ces substances perturberaient la PCR de second tour et provoqueraient l'accumulation de produits non spécifiques, conduisant à des frottis évidents sans GO (Figure 2D et E). Cependant, après avoir ajouté S-GO ou L-GO, les bandes de frottis ont disparu. Les produits non spécifiques ont diminué avec l'augmentation de la concentration de S-GO et L-GO. L-GO a eu un meilleur effet que S-GO, car il avait une plage de concentration efficace plus large pour améliorer la spécificité de la PCR (1,6𔃁.2 μg mL 𕒵 pour S-GO contre 0,8𔃂,8 μg ml 𕒵 pour le tableau L-GO S6).

Figure 2 Effet de GO avec différentes tailles sur les PCR de premier et de second tour.
Remarques: M : marqueur ADN. (UNE) S-GO dans le PCR de premier tour. (B) L-GO dans le PCR de premier tour. (C) Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de GO dans la PCR de premier tour. () S-GO dans le PCR de second tour. (E) L-GO dans le PCR de second tour. (F) Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de GO dans la PCR de second tour. La concentration de GO dans les voies 1 82117 est de 0 μg ml 𕒵 , 0,8 μg ml 𕒵 , 1,6 μg ml 𕒵 , 3,2 μg ml 𕒵 , 4,8 μg ml 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 et 8,0 μg mL 𕒵 , respectivement.
Abréviations : GO, oxydes de graphène L-GO, grandes PCR GO, réactions en chaîne par polymérase S-GO, petite GO.

Notre hypothèse de travail pour l'effet de concentration de GO observé est la suivante. Lorsque la concentration de GO est faible, la quantité adsorbée de charge positive Pfu polymérase et Mg 2 & 43 sur une surface GO chargée négativement était relativement élevée. Ensuite, les molécules chargées négativement, telles que la matrice d'ADN, les amorces et les dNTP, sont attirées par des molécules chargées positivement. Pfu polymérase sur la surface GO. Ainsi, la probabilité de mésappariement est diminuée et la spécificité de la PCR est améliorée. Cependant, en augmentant davantage la concentration de GO, la quantité de GO chargée négativement augmente dans le système PCR, de sorte que la quantité adsorbée de GO chargée positivement Pfu la polymérase et le Mg 2 & 43 sur une seule surface GO diminuent. De plus, les charges négatives en excès de GO repousseront les amorces et les dNTP chargés négativement, conduisant à la suppression de la PCR. Nous avons mesuré les potentiels zêta de GO et son mélange avec Pfu polymérase dans l'eau (tableau S4). Le potentiel zêta de S-GO est passé de 󔼵.1۪.6 mV à 󔼩.2۪.9 mV, tandis que le potentiel zêta de L-GO est passé de 󔼫.6۪.8 mV à 󔼥.8۫.1 mV , confirmant une interaction électrostatique plus forte entre S-GO et Pfu polymérase que celle de L-GO et Pfu polymérase. La tendance similaire est obtenue dans le tampon PCR (tableau S5). Le résultat est attribué à une teneur plus élevée en groupes carboxyle chargés négativement dans S-GO (9,01 & 37) que celle de L-GO (8,17 & 37). Par conséquent, S-GO inhibe la PCR à une concentration plus faible (1,6 μg mL 𕒵 ) que L-GO (6,4 μg mL 𕒵 ) et L-GO a une plage de concentration plus large pour améliorer la spécificité de la PCR .

L'effet du degré de réduction de GO sur la PCR

Nous avons préparé le RGO en utilisant de l'hydrazine comme réducteur dans l'ammoniac. Les titrages de Boehm et le TGA (Figure S7A) ont montré que la teneur en carboxyle était réduite de 8,39 & 37 à 5,43 & 37 après la réduction. Les potentiels zêta ont été augmentés de 󔼯.1۪,5 mV à 󔼗,6۪.3 mV après réduction. Dans la PCR de premier tour, l'intensité des bandes diminuait avec l'augmentation des concentrations de GO et RGO (figure 3A & 8211D). Dans le même temps, l'effet d'inhibition a été diminué avec la réduction de la teneur en groupes carboxyle sur GO. Dans la PCR de second tour, des bandes de frottis évidentes sont apparues et ont diminué avec l'augmentation des concentrations de GO et RGO. La plage de concentration efficace pour une spécificité optimale de la PCR de GO (8,39&37), RGO (7,28&37) et RGO (5,43&37) est de 0,8&82113.2&956g ml&87221, 3,2&82114,8 μg mL 𕒵 et 0,8𔃄.4 μg mL 𕒵 , respectivement. La spécificité de la PCR augmente et l'effet d'inhibition sur la PCR diminue avec la diminution des teneurs en carboxyle dans GO, démontrant que les groupes carboxyle sur GO ont un effet significatif sur la PCR. RGO a moins de charges négatives que GO, ce qui entraîne moins de répulsion électrostatique avec les composants PCR chargés négativement. De plus, une interaction d'empilement plus forte entre les structures cycliques des bases nucléiques et la structure hydrocarbonée polyaromatique de RGO conduit à une plus grande affinité de RGO avec les brins d'ADN que celle de GO avec l'ADN. RGO a un réseau hexagonal plus parfait que GO, il a donc des interactions hydrophobes et d'empilement plus fortes avec Pfu polymérase que GO avec Pfu polymérase. Les Pfu la polymérase est composée de 775 acides aminés, dont 26 phénylalanines, 47 tyrosines et 11 tryptophanes, que toutes ces molécules contiennent des cycles benzéniques. Les riches benzènes non polaires de ces acides aminés aromatiques peuvent se lier fortement à la feuille de graphène via l'interaction π–π. 44 Par conséquent, RGO est supérieur à GO pour améliorer la spécificité de la PCR en raison d'une répulsion moins électrostatique avec les composants PCR chargés négativement et d'une affinité plus élevée avec la matrice d'ADN et Pfu polymérase. L'absorption électrostatique entre les charges positivement Pfu polymérase et RGO est plus petit que celui entre Pfu polymérase et GO avec plus de charges négatives, et l'interaction hydrophobe est la force motrice de l'adsorption enzymatique sur RGO. 45 Ainsi, RGO a une affinité plus forte avec Pfu polymérase que GO. Cette conclusion a été étayée par l'analyse calorimétrique de titrage isotherme (ITC) (tableau S7 et figure S9). Les constantes de dissociation (K) pour le graphène–Pfu l'interaction polymérase était de 12,3 mol 𕒹, 10,5 mol 𕒹 et 3,96 mol 𕒹 pour GO (8,39% carboxyle), RGO (7,28% carboxyle) et RGO (5,43% carboxyle), respectivement. Les valeurs négatives du changement d'énergie libre de Gibbs (Δg) a confirmé la liaison spontanée du graphène avec Pfu polymérase. 46,47 Plus RGO (5,43 & 37) avait le plus bas K et plus négatif Δg valeurs, indiquant une affinité plus élevée entre RGO et Pfu polymérase qu'entre GO et Pfu polymérase.

figure 3 Effet du degré de réduction de GO sur la PCR.
Remarques: (UNE) GO (8,93 & 37) dans le PCR de premier tour. (B) RGO (7,28 & 37) dans le PCR du premier tour. (C) RGO (5,43 & 37) dans le PCR du premier tour. () Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de GO et RGO dans la PCR de premier tour. (E) GO (8,93 & 37) dans le PCR de deuxième tour. (F) RGO (7,28 & 37) dans le PCR de deuxième tour. (g) RGO (5,43 & 37) dans le PCR de deuxième tour. (H) Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de GO et RGO dans la PCR de second tour. M : marqueur ADN. Les pourcentages indiquent la teneur en groupes carboxyle déterminée par titrage TGA et Boehm en GO et RGO. La concentration de GO et RGO dans les voies 1𔃅 est de 0 μg mL 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2 μg mL 𕒵 , 4,8 & #956g mL 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 et 8,0 μg mL 𕒵 , respectivement.
Abréviations : GO, oxyde de graphène RGO, PCR d'oxyde de graphène réduit, réaction en chaîne par polymérase TGA, analyse thermogravimétrique.

L'effet de la modification de surface GO sur la PCR

Pour étudier plus avant l'effet de la modification de surface GO sur la spécificité de la PCR, nous avons modifié GO avec du PAA chargé négativement, du PAM chargé positivement, du PEG neutre et du pSB zwitterionique. Dans la PCR du premier tour, aucune bande de frottis n'a été trouvée pour tous les échantillons, indiquant une bonne spécificité de la PCR (Figure 4A & 8211E). Dans la PCR de second tour, des frottis non spécifiques sont apparus dans les expériences de contrôle sans additifs, mais les frottis diminuaient avec l'augmentation des concentrations de dérivés GO, indiquant que la spécificité de la PCR est améliorée dans tous les systèmes de PCR assistés par dérivés GO. Par rapport à GO-PAA, GO-PAM et GO-PEG, GO-pSB a des bandes de frottis plus petites (Figure 4F–J) et une plage de concentration efficace plus large (9,6󈞄,0 μg mL 𕒵 Tableau S6), indiquant que GO-pSB a une meilleure performance pour améliorer la spécificité de la PCR que d'autres GO modifiés aux polymères. La capacité d'améliorer la spécificité de la PCR augmente dans l'ordre suivant : GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Les résultats indiquent que GO-pSB est supérieur à d'autres GO modifiés par polymère pour améliorer la spécificité de la PCR. Le tableau S6 compare la plage de concentration efficace pour une spécificité optimale de la PCR de GO, RGO, GO modifiée par polymère et quatre polymères selon les résultats de la PCR de second tour. Par rapport à RGO, GO-pSB a une bien meilleure solubilité. Pendant ce temps, il a également une plage de concentration efficace beaucoup plus large que GO et RGO.

Figure 4 Effet des dérivés GO sur les PCR de premier et deuxième tours.
Remarques: M : marqueur ADN. La concentration de dérivé GO dans les pistes 1𔃆 en (UNE), (B), (F) et (g) est de 0 μg ml 𕒵 , 0,8 μg ml 𕒵 , 1,6 μg ml 𕒵 , 3,2 μg ml 𕒵 , 4,8 μg ml 𕒵 , 6,4 &# 956g mL 𕒵 , 8,0 μg mL 𕒵 et 9,6 μg mL 𕒵 , respectivement. La concentration de dérivé GO dans les voies 1𔃄 en (C), (), (H) et (je), est de 0 μg ml 𕒵 , 4,8 μg ml 𕒵 , 9,6 μg ml 𕒵 , 14,4 μg ml 𕒵 , 19,2 μg ml 𕒵 et 24,0 & #956g mL 𕒵, respectivement. Les teneurs en PAA, PAM, PEG et pSB dans les dérivés GO sont respectivement de 43,48&37, 40,96&37, 42,53&37 et 38,70&37. (E) Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de dérivés GO en PCR de 1er tour. (J) Intensité de la bande PCR à différentes concentrations de dérivés GO en PCR de 2e tour.
Abréviations : GO, oxyde de graphène PAA, acide polyacrylique PAM, PCR polyacrylamide, réactions en chaîne par polymérase PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne).

Afin de confirmer que l'amélioration de la spécificité de la PCR résulte des GO modifiés par des polymères et non des polymères, nous avons étudié l'effet des polymères nus sur la spécificité de la PCR sans GO. Les quantités calculées de polymères selon les données TGA des dérivés GO ont été ajoutées dans le système PCR. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de changement dans la bande (Figure S10). Ce n'est que lorsque la concentration de polymère a été augmentée de &# 621 000 fois, passant de microgramme par millilitre à milligramme par millilitre, que la spécificité de la PCR a pu être améliorée (figure S11). Ces résultats indiquent que l'amélioration de la spécificité de la PCR résulte de la GO modifiée par polymère et non des polymères nus. Sur la base des résultats précédents, GO n'est pas un bon activateur de la spécificité de la PCR. Ainsi, l'amélioration de la spécificité de la PCR par le dérivé de GO est attribuée à la combinaison ou à l'effet synergique de GO et de polymères.

La figure 5 montre qu'à des concentrations élevées de GO ou de dérivés GO, les bandes témoins (piste 1) sont inhibées. Afin de tester si Pfu la polymérase est adsorbée sur les surfaces de GO et de ses dérivés, du BSA a été ajouté dans le système PCR inhibé par un excès de GO et de dérivés de GO. Après l'ajout de BSA, toutes les PCR sont récupérées et les intensités de bande augmentent avec l'augmentation de la concentration de BSA. Le résultat est attribué à l'adsorption compétitive de BSA à la surface de GO et de ses dérivés. Ainsi, l'adsorbé Pfu la polymérase a été libérée dans la solution, entraînant la récupération de la PCR. Les résultats indiquent qu'il existe une forte interaction entre les dérivés GO ou GO et Pfu polymérase. Nous avons également incubé GO et ses dérivés avec Pfu polymérase pendant 1 heure dans de la glace pour permettre une absorbance suffisante de Pfu polymérase avec GO ou ses dérivés. Ensuite, nous avons ajouté d'autres composants PCR et effectué des PCR. La figure S12 confirme une PCR efficace après adsorption de Pfu polymérase sur GO ou ses dérivés.

Figure 5 Effet de la BSA sur la PCR inhibée par GO et ses dérivés.
Remarques: M : marqueur ADN. (UNE) ALLER (9,6 μg mL 𕒵 ), (B) GO-PAA (4,8 μg mL 𕒵 ), (C) GO-PAM (8,0 μg mL 𕒵 ). () GO-PEG (24,0 μg mL 𕒵 ) et (E) GO-pSB (24,0 μg mL 𕒵 ). La concentration de BSA dans les couloirs 1 82114 est de 0 956g mL 𕒵, 2,0 μg mL 𕒵, 20,0 μg mL 𕒵 et 200,0 μg mL 𕒵, respectivement.
Abréviations : BSA, albumine de sérum bovin GO, oxyde de graphène PAA, acide polyacrylique PAM, polyacrylamide PCR, amplification en chaîne par polymérase PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne).

La PCR a été inhibée lorsque la concentration du dérivé de GO a été encore augmentée (figure 4). Chaque feuille GO peut adsorber une charge positive Pfu polymérase ou Mg 2 & 43 en raison de sa grande surface spécifique et de ses nombreux groupes carboxyle chargés négativement. L'augmentation de la concentration du dérivé GO diminuera la quantité d'adsorption de Pfu polymérase et Mg 2 & 43 sur une seule feuille GO, ce qui réduit l'efficacité de la PCR. Lorsqu'un excès de Mg 2 & 43 est ajouté dans le système PCR, davantage de Mg 2 & 43 sera davantage adsorbé sur les dérivés GO chargés négativement avec Pfu polymérase pour récupérer la PCR. La figure 6 montre que les bandes inhibées sont récupérées après l'ajout de 1𔃀 mM Mg 2+. Par conséquent, les résultats indiquent en outre que la PCR sera inhibée si le Pfu polymérase et Mg 2 & 43 adsorbés lors de la diminution d'un seul dérivé GO.

Figure 6 Effet de la concentration en Mg 2+ sur la PCR assistée par GO et ses dérivés.
Remarques: M : marqueur ADN. (UNE) ALLER (9,6 μg mL 𕒵 ). (B) GO-PAA (4,8 μg mL 𕒵 ). (C) GO-PAM (8,0 μg mL 𕒵 ). () GO-PEG (24,0 μg mL 𕒵 ). (E) GO-pSB (24,0 μg mL 𕒵 ). La concentration de Mg 2&43 ajouté dans les pistes 1&82114 est de 0 mM, 0,4 mM, 1,0 mM et 2,0 mM, respectivement (le Mg 2&43 original de 2 mM n'a pas été inclus).
Abréviations : GO, oxyde de graphène PAA, acide polyacrylique PAM, polyacrylamide PCR, amplification en chaîne par polymérase PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne).

Pfu la polymérase possède une activité de relecture et peut être utilisée à la place de Taq polymérase pour effectuer une plus grande fidélité de la synthèse d'ADN. Pour confirmer si GO ou ses dérivés affecteraient la fidélité de la PCR, tous les produits de PCR en l'absence ou en présence de GO et de ses dérivés ont été séquencés. Les données confirment que GO et ses dérivés n'ont aucun effet sur la fidélité des Pfu polymérase (Figure S13). Les résultats indiquent en outre que la spécificité de la PCR est améliorée et la fidélité des Pfu la polymérase est garantie en présence de dérivés GO.

L'application dans les échantillons cliniques

Enfin, les dérivés GO ont également été utilisés pour améliorer la spécificité de la PCR pour amplifier les échantillons cliniques complexes. L'ADN génomique du sang humain a été utilisé comme matrice. Un fragment de 324 pb de l'ADN mitochondrial a été amplifié. Dans les PCR de premier et de second tour, aucune bande de frottis n'est observée pour tous les échantillons, mais la bande cible est plus faible pour la PCR de second tour sans dérivé GO que celle de l'échantillon avec dérivés GO (Figure 7). Dans la PCR de troisième tour, il existe une forte bande de frottis pour la PCR sans dérivé GO et la bande cible devient négligeable. Cependant, les bandes cibles sont toujours remarquables avec de faibles produits non spécifiques en présence de dérivés GO. Par conséquent, les dérivés GO améliorent la spécificité de la PCR pour amplifier les échantillons cliniques complexes. Les résultats indiquent que les dérivés de GO peuvent avoir des applications potentielles dans le diagnostic moléculaire clinique.

Figure 7 L'application de dérivés GO pour amplifier des échantillons cliniques.
Remarques: Le modèle est de l'ADN mitochondrial provenant de l'ADN génomique du sang humain obtenu à partir d'échantillons cliniques. M : marqueur ADN 1 : PCR de premier tour 2 : PCR de second tour 3 : PCR de troisième tour C : expériences témoins sans dérivés GO. Les concentrations de GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG et GO-pSB sont de 0,6 μg mL 𕒵 , 2,4 μg mL 𕒵 , 4,8 μg mL 𕒵 et 19,2 μg ml 𕒵, respectivement.
Abréviations : GO, oxyde de graphène PAA, acide polyacrylique PAM, polyacrylamide PCR, amplification en chaîne par polymérase PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne).

Simulation de l'interaction entre la polymérase et le polymère

Il est très difficile de simuler directement l'interaction entre la polymérase et la GO modifiée par polymère. Ainsi, la simulation de la dynamique moléculaire et l'amarrage moléculaire ont été utilisés pour étudier l'interaction possible entre le polymère et Pfu polymérase lorsque GO a été négligée par souci de simplification. Pfu polymérase contient les cinq domaines suivants : le N-terminal (résidus 1� et 327�), l'exonucléase (131�), la paume (369� et 501�), les doigts (451�) et les domaines du pouce ( 589�) (Figure S14). Le mécanisme de relecture et de polymérisation est coordonné à partir des interactions entre la boucle (144 & 8211158) du domaine exonucléase et le bord chargé positivement du domaine du pouce. 48 L'amarrage moléculaire a montré que les sites de liaison des polymères étaient situés au niveau de l'exonucléase, du pouce, de la paume et des doigts par des calculs d'amarrage (Figure S14). Les affinités de liaison ont diminué dans l'ordre suivant : PAA > PAM > PEG > pSB (tableau S8). Les énergies de Coul Short Range ont considérablement fluctué au cours de l'équilibrage de 10 ns, atteignant une stabilité après Ӱ ns (Figure S15A et B). L'analyse d'énergie Coul Short Range indique qu'il existe une forte interaction électrostatique entre le PAA et Pfu (𕒶,248𫐳 kJ mol 𕒵 ). L'énergie Coul à courte portée de Pfu-PAM est �𫏓 kJ mol 𕒵 , tandis que le PEG et le pSB n'ont pratiquement aucune interaction électrostatique avec Pfu (Tableau S9). Cet ordre est cohérent avec les résultats de la PCR (Figure S11). La surface accessible au solvant (SASA) est la surface d'une biomolécule accessible à un solvant. SASA de Pfu-PEG et Pfu-pSB sont presque équivalents en 10 ns (Figure S15C), indiquant que le PEG et le pSB ont une influence similaire sur la liaison enzymatique au substrat. La distance minimale de PEG et Pfu fluctue dans une large gamme, indiquant une plus grande flexibilité de PEG que pSB (Figure S15D).La distribution cumulative des solvants montre que la zone dipolaire de la molécule de solvant autour du PEG est beaucoup plus grande que celle du pSB (figure S15E et F), indiquant que le PEG et le pSB affectent le solvant et la protéine à différents niveaux. Des simulations de dynamique moléculaire ont montré que le PfuComplexe –PAA (PAA : la bande brune ci-dessous Pfu) a eu l'interaction la plus forte suivie de Pfu–PAM complexe (PAM : la bande bleue ci-dessous Pfu) (Figure 8A et B). L'interaction serait des interactions électrostatiques et hydrophobes et la force de van der Waals’. De toute évidence, il n'y a pas d'interaction directe entre Pfu polymérase et PEG, et Pfu polymérase et pSB (Figure 8C et D). Ces résultats sont cohérents avec l'analyse énergétique Coul Short Range. Les résultats de la simulation de la dynamique moléculaire et de l'amarrage moléculaire sont raisonnables car le PEG peut réduire l'adsorption des protéines, 49 et le polymère zwitterionique a une meilleure capacité à réduire l'adsorption des protéines que le PEG. 50 Affinités de liaison des polymères avec Pfu la polymérase (tableau S8) appuie également le résultat.

Figure 8 Simulations MD de l'interaction de Pfu polymérase avec PAA (UNE), PAM (B), PEG (C) et pSB ().
Abréviations : MD, dynamique moléculaire PAA, acide polyacrylique PAM, polyacrylamide PEG, polyéthylène glycol pSB, poly(sulfobétaïne).

Outre l'interaction entre Pfu polymérase et polymère, GO chargés négativement et chargés positivement Pfu la polymérase a également de fortes interactions électrostatiques, hydrophobes et d'empilement. Le PEG et le pSB diminueront ces interactions en réduisant l'adsorption de Pfu polymérase. Ainsi, GO-PEG et GO-pSB n'inhibent pas la PCR dans une plage de concentration plus large que GO-PAA et GO-PAM, ce qui est cohérent avec les résultats expérimentaux (figure 4). Une petite quantité de charge positive Pfu la polymérase est toujours adsorbée par le GO chargé négativement dans le GO-PEG et le GO-pSB, même si le PEG et le pSB réduiront son adsorption. Ainsi, la spécificité de la PCR est également renforcée par la PCR assistée par dérivé GO. Par conséquent, ces résultats confirment en outre que ces dérivés de GO peuvent améliorer la spécificité de la PCR.

Nous avons étudié l'effet de GO avec différentes tailles, degrés de réduction et modifications de surface sur la spécificité de la PCR. Les résultats indiquent que L-GO et RGO sont supérieurs à S-GO et non-RGO pour améliorer la spécificité de la PCR. Pour les dérivés GO, la capacité à améliorer la spécificité de la PCR augmente dans l'ordre suivant : GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Notre étude démontre que GO et ses propriétés de surface affectent la spécificité de la PCR. Les dérivés GO peuvent être utilisés comme additifs efficaces pour améliorer la spécificité de la PCR dans le diagnostic moléculaire clinique.

Cette étude est soutenue par le National Basic Research 973 Project (2014CB932004) et la National Natural Science Foundation of People’s Republic of China (31371005, 81571764 et 81171453). Nous remercions le professeur Zhiliang Ji du State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University, pour sa suggestion dans la simulation. Nous remercions le docteur Yoav Peleg du Weizmann Institute of Science, Israël, pour ses bons conseils et sa révision de la langue. Nous remercions également le professeur Chuanliu Wu et son doctorant Yaqi Chen pour leur aimable aide avec toutes les mesures ITC.

Tous les auteurs ont contribué à l'analyse des données, à la rédaction et à la révision critique du document et acceptent d'être responsables de tous les aspects du travail.

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d'intérêt dans ce travail.

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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier des segments d'ADN spécifiques de plusieurs ordres de grandeur. Les segments spécifiques d'ADN sont amplifiés au cours de trois processus, la dénaturation, l'annelage et l'extension - où les brins d'ADN sont séparés en élevant la température à la température optimale par rapport à la température ambiante avant que les amorces ne se lient et que la polymérase aligne les nucléotides sur le brin matrice. Il utilise l'ADN polymérase, qui est légèrement active à basse température. [1] Dans la PCR conventionnelle, le mélange réactionnel est terminé à température ambiante et, en raison de l'activité de l'ADN polymérase, les amorces peuvent former des dimères d'amorces ou s'hybrider à l'ADN de manière non spécifique. Au cours de la procédure de PCR, l'ADN polymérase étendra n'importe quel morceau d'ADN avec des amorces liées, générant des produits cibles mais également des produits non spécifiques qui abaissent le rendement. Dans la PCR à démarrage à chaud, certains des réactifs sont maintenus séparés jusqu'à ce que le mélange soit chauffé à la température de recuit spécifique. Cela réduit le temps d'hybridation, ce qui réduit à son tour la probabilité d'une extension d'ADN non spécifique et l'influence de la liaison d'amorce non spécifique avant la dénaturation. [6] [5]

Dans la PCR conventionnelle, des températures inférieures à la température d'hybridation optimale (50 à 65 °C) entraînent des modifications hors cible telles que des amplifications non spécifiques où les amorces se lieront de manière non spécifique à l'acide nucléique. [5] Ces complexes d'amorces non spécifiques, qui sont en excès dans le mélange, sont à l'origine de la synthèse de sous-produits tels que les dimères d'amorces et les erreurs d'amorçage. [10] Une erreur d'amorçage entrave et réduit considérablement l'efficacité de l'amplification par PCR en rivalisant activement avec les séquences cibles pour l'amplification. De même, les dimères d'amorces forment des complexes qui diminuent la quantité d'amplifications du nombre de copies obtenues. [10] Cela peut être contrôlé en mettant en œuvre une PCR à démarrage à chaud qui permet de bloquer les extensions d'amorces jusqu'à ce que les températures optimales soient atteintes. [2]

Dans la PCR à démarrage à chaud, des réactifs importants (tels que l'ADN polymérase et les cofacteurs de magnésium) ne peuvent pas réagir dans le mélange PCR jusqu'à ce que les températures optimales soient atteintes par une séparation physique ou des modifications chimiques. [5] [2] La PCR de démarrage à chaud peut également se produire lorsque la polymérase Taq est inhibée/inactivée ou que son addition est retardée jusqu'à des températures de recuit optimales, par des modifications de désoxyribonucléotide triphosphate ou en modifiant les amorces par mise en cage et manipulation de structure secondaire.

La PCR de démarrage à chaud est souvent une meilleure approche par rapport à la PCR traditionnelle dans des circonstances où il y a un manque d'ADN dans le mélange réactionnel (>10 4 copies), la matrice d'ADN est très complexe ou s'il y a plusieurs paires d'amorces oligonucléotidiques dans la PCR. [3]

La PCR de démarrage à chaud est une méthode qui empêche l'extension de l'ADN polymérase à basse température pour empêcher la liaison non spécifique afin de minimiser la perte de rendement. La PCR de démarrage à chaud réduit la quantité de liaison non spécifique en limitant les réactifs jusqu'aux étapes de chauffage de la PCR - limitez la réaction tôt en limitant la Taq ADN polymérase dans une réaction. La liaison non spécifique conduit souvent à des dimères d'amorces et à des cibles mal amorcées/fausses amorcées. [11] Ceux-ci peuvent être rectifiés par des méthodes modifiées telles que :

Inactivation/inhibition de la Taq ADN polymérase Modifier

Anticorps liés aux enzymes/Taq ADN polymérase complexés avec des anticorps anti-Taq ADN polymérase :

Les anticorps liés à une enzyme inactivent la Taq ADN polymérase. Les anticorps se lient et se lient à la polymérase, empêchant une amplification précoce de l'ADN qui pourrait se produire à des températures plus basses. Une fois la température d'hybridation optimale atteinte, les anticorps commenceront à se dégrader et à se dissocier, libérant l'ADN polymérase Taq dans la réaction et permettant au processus d'amplification de démarrer. [2] [12] L'ADN polymérase Platinum Taq et l'ADN polymérase AccuStart Taq (développées par Ayoub Rashtchian chez Life technologies et Quanta BioSciences, respectivement) sont des exemples d'ADN polymérases Taq à démarrage à chaud à base d'anticorps disponibles dans le commerce. Ces Taq ADN polymérase sont précomplexées avec un mélange d'anticorps monoclonaux spécifiques de la Taq ADN polymérase. [13]

Une barrière physique est créée entre la Taq ADN polymérase et le reste des composants PCR par les billes de cire qui dépendent de la température. Une fois que la température dépasse 70 °C, lors de l'étape de dénaturation du premier cycle, la perle de cire fond, permettant à l'ADN polymérase Taq de s'échapper au-delà de la barrière et d'être libérée dans la réaction, ce qui démarre le processus d'amplification. La couche de cire se déplace ensuite vers le haut du mélange réactionnel pendant l'étape d'amplification pour agir plus tard comme un pare-vapeur. [2]

Oligonucléotides hautement spécifiques :

Les oligonucléotides sont de courts polymères d'acide nucléique qui se lient facilement. Des oligonucléotides hautement spécifiques, tels que des aptamères, se lient à l'ADN polymérase Taq à des températures plus basses, la rendant inactive dans le mélange. Ce n'est qu'à des températures plus élevées que les oligonucléotides se sépareront de la Taq lui permettant de réagir. [5]

Ce sont les méthodes les plus efficaces pour la PCR de démarrage à chaud, les méthodes d'anticorps liés à des enzymes et d'oligonucléotides hautement spécifiques en particulier sont les plus adaptées lors de procédures qui nécessitent un temps d'inactivation plus court. [14] Cependant, d'autres méthodes sont connues pour être mises en œuvre telles que :

Ajout tardif de la Taq ADN polymérase Modifier

La machine PCR est chauffée à l'avance tandis que les composants sont mélangés sur de la glace, puis immédiatement placés dans la machine PCR une fois qu'elle atteint la température optimale. Cela éliminerait le processus de préchauffage requis, réduirait l'hybridation non spécifique des amorces et garantirait que toutes les amorces mal appariées dans le mélange sont séparées. [15]

La congélation agit comme une forme de séparation physique tout comme les perles de cire. Le mélange réactionnel contenant les amorces, le brin matrice, l'eau et le désoxyribonucléotide triphosphate (dNTP) est congelé avant la Taq polymérase et les composants PCR restants sont ajoutés au-dessus du mélange congelé. Cela agit pour empêcher la liaison non spécifique. [15]

Les composants de la PCR dans le mélange réactionnel sont préparés et chauffés sans ajout de Taq. La Taq n'est ensuite introduite dans le mélange qu'une fois la température optimale atteinte. Cependant, cette méthode est la moins fiable et peut conduire à une contamination des composants. [15]

Une autre méthode consiste à utiliser la PCR de démarrage à chaud médiée par le désoxyribonucléotide triphosphate qui modifie les bases nucléotidiques par l'intermédiaire d'un groupe protecteur.

Modifications du désoxyribonucléotide triphosphate (dNTP) Modifier

Le dNTP de démarrage à chaud peut être modifié chimiquement pour inclure un groupe protecteur sensible à la chaleur à la 3e extrémité principale. Cette modification empêchera les nucléotides d'interagir avec la polymérase Taq pour se lier au brin matrice jusqu'à ce que les températures optimales soient atteintes. Par conséquent, le groupe protecteur sera éliminé pendant l'étape d'activation thermique. Les hot start dNTP, dA, dT, dC et dG remplacent les nucléotides naturels. [16] [17] L'utilisation des quatre nucléotides modifiés est cependant recommandée, des recherches antérieures montrent qu'en remplaçant un ou deux des nucléotides naturels par les dNTP modifiés, il suffirait de garantir qu'une amplification non spécifique ne se produise pas. [16] [17] Une autre modification chimique de l'acide nucléique se fait par la modification covalente thermoréversible qui agit pour empêcher l'hybridation des amorces à la matrice d'intérêt. Le groupe amino guanosine interagit avec le glyoxal pour former dG. [18]

Amorces modifiées Modifier

Certaines structures secondaires peuvent entraver les fonctions des amorces. Par exemple, les oligonucléotides avec une structure en épingle à cheveux ne peuvent pas agir efficacement comme amorce. Cependant, après avoir chauffé le mélange réactionnel à la température d'hybridation, l'amorce subira un changement de conformation permettant à l'amorce de former une structure linéaire à la place, ce qui permet à l'amorce de se fixer au segment cible et de commencer la PCR. [19] [20]

Cages amovibles photochimiquement :

Un groupe de mise en cage qui est un groupe protecteur qui est photochimiquement éliminable, tel que des thymidine phosphoramidites en cage, est incorporé dans une amorce oligonucléotidique. Cela permet d'activer et de désactiver la fonction de l'amorce grâce à l'utilisation d'un rayonnement UV (365 nm). Par conséquent, les amorces peuvent être activées une fois la température de recuit atteinte. [21]

Ajout contrôlé de magnésium Modifier

Le magnésium est requis dans la PCR et agit comme cofacteur car la Taq polymérase est dépendante du magnésium. [22] L'augmentation de la concentration de magnésium et de phosphate aux réactifs tampons standard crée un précipité de magnésium, fournissant un démarrage à chaud pour la réaction car il n'y a pas de magnésium pour l'ADN polymérase jusqu'à l'étape de cyclage thermique. Pendant le cycle thermique, le magnésium se dissoudra en solution et deviendra disponible pour la polymérase à utiliser, lui permettant de fonctionner normalement. [23]

La PCR de démarrage à chaud est avantageuse en ce qu'elle nécessite moins de manipulation et réduit le risque de contamination. La PCR de démarrage à chaud peut être modifiée chimiquement ou à base d'anticorps, ce qui offre différents avantages à la procédure. Dans la PCR à démarrage à chaud chimiquement modifiée, la procédure peut être effectuée à température ambiante et diminue considérablement la formation d'amorces-dimères en empêchant les amorces de se lier les unes aux autres avant le début du processus de PCR et en limitant l'amorçage non spécifique. De même, la PCR hot start inhibe la liaison des amorces aux séquences matrices qui ont une faible homologie qui conduit à une erreur d'amorçage. Il peut également améliorer la spécificité et la sensibilité, en raison des conditions strictes, ainsi qu'augmenter le rendement en produit du fragment ciblé. [5] Dans la PCR à démarrage à chaud à base d'anticorps, la polymérase est activée après l'étape de dénaturation initiale au cours du processus de cyclage, réduisant ainsi le temps nécessaire. Cela conduit également à une spécificité élevée. [14]

Outre ses avantages, la PCR à démarrage à chaud présente également des limites qui doivent être prises en compte avant de mettre en œuvre la méthode. La PCR à démarrage à chaud nécessite l'ajout de chaleur pendant des périodes plus longues par opposition à la PCR conventionnelle, par conséquent, l'ADN matrice est plus susceptible d'être endommagé. Le temps de chauffage accru signifie également que la procédure n'est pas compatible avec certaines procédures telles que la méthode de transcription inverse-PCR à un seul tube et tampon unique qui nécessite une température plus basse pour subir l'étape de transcription inverse. [12] Dans la PCR hot start chimiquement modifiée, le processus d'amplification de l'ADN peut être affecté négativement d'une part en raison d'une augmentation significative du temps de réactivation nécessaire à l'activation de la polymérase et d'autre part si la longueur de la matrice d'ADN cible est trop longue. [14] Dans les procédures basées sur les anticorps, chaque enzyme nécessite un anticorps différent et, par conséquent, le coût pour effectuer la procédure est plus élevé [15]


Tableau de sélection de l'ADN polymérase

Le tableau suivant répertorie les propriétés à prendre en compte lors du choix d'une polymérase. Étant donné que ces propriétés peuvent dépendre des conditions de réaction, les références primaires doivent être consultées avant utilisation dans une application donnée.

PCR polymérases Exonucléase 3&prime&ndash>5&prime fidélité 5&prime&ndash>3&prime Exonucléase Déplacement de brin Nick Traduction Étendre l'amorce d'ARN Extension de Nick dU Tolérance Fins résultantes Formats populaires disponibles Applications
PCR haute fidélité
Q5 ® ADN polymérase haute fidélité ++++ 280x Taq Non _ Non Non Non Non Cru Q5 ® ADN polymérase haute fidélité PCR ultra haute fidélité, PCR longue portée, clonage à partir de matériel in vitro pour l'expression de protéines ou l'analyse de gènes, analyse SNP via clonage et séquençage, mutagenèse dirigée
Q5 ® ADN polymérase haute fidélité Hot Start
Q5 ® ADN polymérase haute fidélité 2x Master Mix
Q5 ® High-Fidelity Hot Start ADN Polymérase 2x Master Mix
NEBNext ® Ultra&trade II Q5 ® Master Mix Préparation de la bibliothèque NGS
Q5U ® ADN polymérase haute fidélité Hot Start ++++ Non _ Non Non Non Oui Cru Q5U ® ADN polymérase haute fidélité Hot Start Clonage USER, amplification haute fidélité de substrats d'ADN convertis au bisulfite ou désaminés, prévention du transfert
NEBNext Q5U ® Master Mix
Phusion ® ADN polymérase haute fidélité* ++++ 39b -50xc Taq Non _ Non Non Non Non Cru Phusion ® ADN polymérase haute fidélité PCR haute fidélité, clonage
Phusion ® High Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF
Phusion ® High Fidelity PCR Master Mix avec tampon GC
Phusion ® Hot Start Flex ADN polymérase
Phusion ® Hot Start Flex 2X Master Mix
PCR de routine
UneTaq ® ADN polymérase ++ 2x Oui _j Oui Non Oui Oui 3'A/Émoussé UneTaq ® ADN polymérase PCR de routine, PCR sur colonies, dépistage du génotype
UneTaq ® ADN polymérase Hot Start
UneTaq ® et UnTaq ® Hot Start 2x Master Mix
UneTaq ® ADN polymérase à chargement rapide
UneTaq ® Quick-Load ® 2X Master Mix
Taq ADN polymérase _ 1 fois Oui _j Oui Non Oui Oui 3'A TaqADN polymérase avec tampon Thermopol PCR de routine
Démarrage à chaud TaqADN polymérase
Taq et démarrage à chaud Taq 2X Master Mix
Chargement rapide Taq 2X Master Mix
Multiplex PCR 5X Master Mix PCR de point final multiplex
PCR de spécialité
LongAmp ® Taq ADN polymérase ++ 2x Oui _je Oui Non Oui Oui 3'A/Émoussé LongAmp ® Taq ADN polymérase PCR longue portée pour des modèles complexes et simples
LongAmp ® Hot Start Taq ADN polymérase
LongAmp ® Taq 2X Master Mix
LongAmp ® Hot Start Taq 2X Master Mix
Hemo KlenTaq _ Non _ Non Non Non Oui 3'A Hemo KlenTaq PCR directe sur le sang
Epimark ® Hot Start Taq ADN polymérase _ Oui _j Oui Non Oui Oui 3'A Epimark ® Hot Start Taq ADN polymérase Amplification d'ADN converti au bisulfite, matrices riches en AT
Amplification isotherme et déplacement de brin Exonucléase 3&prime&ndash>5&prime Taux d'erreur (x 10 -6 )
5&prime&ndash>3&prime Exonucléase Déplacement de brin Nick Traduction Étendre l'amorce d'ARN Extension de Nick dU Tolérance Fins résultantes Formats populaires disponibles Applications
Bst ADN polymérase, pleine longueur _ Oui _j
Oui Oui Oui Oui 3'A Bst ADN polymérase, pleine longueur Nick traduction
Bst ADN polymérase, grand fragment _ Non ++++ Non Oui Oui Oui 3'A Bst ADN polymérase, grand fragment Diagnostic moléculaire d'amplification isotherme (LAMP, SDA), diagnostic de terrain
ADN polymérase Bst 2.0 _ 62 (±5) e Non ++++ Non Oui Oui Oui 3'A ADN polymérase Bst 2.0
Bst 2.0 WarmStart ® ADN polymérase
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix avec UDG
Kit WarmStart ® LAMP (ADN & ARN)
WarmStart ® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (ADN & ARN amp)
Bst 3.0 ADN polymérase _ 70 (±23) e Non ++++ Non Oui Oui Oui 3'A Bst 3.0 ADN polymérase
ADN polymérase Bsu, grand fragment _ Non + Non Oui Oui Oui 3'A ADN polymérase Bsu, grand fragment Amplification isotherme (RPA, SDA, RCA)
ADN polymérase phi29 ++++ 5 je Non + Non Oui Oui k Oui Cru ADN polymérase phi29 WGA
Polymérases pour la manipulation de l'ADN Exonucléase 3&prime&ndash>5&prime Taux d'erreur (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime Exonucléase Déplacement de brin Nick Traduction Étendre l'amorce d'ARN Extension de Nick dU Tolérance Fins résultantes Formats populaires disponibles Applications
ADN polymérase T7 (non modifiée) ++++ 15h Non _ Non Oui Non Cru ADN polymérase T7 (non modifiée)
Sulfolobus ADN polymérase IV _ Non _ Non 3'A Sulfolobus ADN polymérase IV Pontage trans-lésionnel
Therminator&trade ADN polymérase _ Non + Non Oui Oui Oui 3'A Therminator&trade ADN polymérase Terminateur de chaîne
ADN polymérase I (E. coli) ++ 9 f Oui _j Oui Oui Oui Oui Cru ADN polymérase I (E. coli) Synthèse du deuxième brin, translation de coupure
ADN polymérase I, grand fragment (Klenow)' ++ 18 grammes Non + Non Oui Oui Oui Cru ADN polymérase I, grand fragment (Klenow)' Émoussage, extension d'apprêt
Fragment de Klenow (3&prime&rarr5&prime exo_) _ 100g Non +++ Non Oui Oui Oui 3'A Fragment de Klenow (3&prime&rarr5&prime exo_) Un étiquetage d'amorçage aléatoire de queue
ADN polymérase T4 ++++ <1 f Non _ Non Oui Non Cru ADN polymérase T4 émousser
Polymérases héritées Exonucléase 3&prime&ndash>5&prime Taux d'erreur (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime Exonucléase Déplacement de brin Nick Traduction Étendre l'amorce d'ARN Extension de Nick dU Tolérance Fins résultantes Formats populaires disponibles Applications
Vent ® ADN polymérase ++ Non + Non Non Oui Non Cru Vent ® ADN polymérase
Vent ® (exo&ndash) ADN polymérase _ Non +++ Non Non Oui Non 3'A Vent ® (exo&ndash) ADN polymérase
Deep Vent ® ADN polymérase +++ Non ++ Non Non Oui Non Cru ADN polymérase Deep Vent ®
ADN polymérase Deep Vent ® (exo&ndash) _ Non +++ Non Non Oui Non 3'A ADN polymérase Deep Vent ® (exo&ndash)

Deep Vent ® et Therminator&trade sont des marques déposées de New England Biolabs, Inc.
Q5 ® , Q5U ® , LongAmp ® , UnTaq ® , Vent ® sont des marques déposées de New England Biolabs, Inc.

* Avis aux clients :
L'ADN polymérase Phusion ® a été développée par Finnzymes Oy, qui fait maintenant partie de Thermo Fisher Scientific. Ce produit est fabriqué par New England Biolabs, Inc. en accord avec et selon les spécifications de performance de Thermo Fisher Scientific.
Phusion ® est une marque déposée et la propriété de Thermo Fisher Scientific.


Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par un financement du ministère des Sciences et de la Technologie de Chine (No. 2015CB553402 et No. 2016YFC0206300 à TFZ No. 2017YFA0505200 à LL), la National Natural Science Foundation of China (No. 31470532, No. 91543102, et No.31711530153 à TFZ No. 21532004 à LL), le Beijing Nova Program (No. Z171100001117011 à TFZ), le Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (No. 20161080152 à TFZ), le Tsinghua University-Peking University Center for Life Sciences (CLS) et le Centre d'innovation avancée de Pékin pour la biologie structurale.


Réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse (RT-PCR)

Dans la RT-PCR, une population d'ARN est convertie en ADNc par transcription inverse (RT), puis l'ADNc est amplifié par la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Figure 1). L'étape d'amplification de l'ADNc offre des opportunités d'étudier plus avant les espèces d'ARN d'origine, même lorsqu'elles sont limitées en quantité ou exprimées en faible abondance. Les applications courantes de la RT-PCR comprennent la détection des gènes exprimés, l'examen des variantes de transcrits et la génération de modèles d'ADNc pour le clonage et le séquençage.

Étant donné que la transcription inverse fournit des modèles d'ADNc pour l'amplification par PCR et les expériences en aval, il s'agit de l'une des étapes les plus critiques pour le succès expérimental. La transcriptase inverse sélectionnée devrait offrir la plus grande efficacité, même avec des échantillons d'ARN difficiles, tels que ceux qui sont dégradés, ont des inhibiteurs de transfert ou possèdent un degré élevé de structure secondaire. (Papier blanc:transcriptase inverse modifiée)

Lors de la réalisation de la RT-PCR, les méthodes en une étape et en deux étapes sont les deux approches courantes, chacune avec ses propres avantages et inconvénients (Figure 2). Comme le nom l'indique, RT-PCR en une étape combine la synthèse d'ADNc du premier brin (RT) et la PCR ultérieure dans un seul tube de réaction. Cette configuration de réaction simplifie le flux de travail, réduit les variations et minimise la contamination possible. La RT-PCR en une étape permet de traiter plus facilement un grand nombre d'échantillons, ce qui la rend adaptée aux applications à haut débit. Cependant, la RT-PCR en une étape utilise des amorces spécifiques aux gènes pour l'amplification, limitant l'analyse à quelques gènes par échantillon d'ARN. Étant donné que la réaction est un compromis entre les conditions de transcription inverse et d'amplification, la RT-PCR en une étape pourrait être moins sensible et moins efficace dans certains scénarios. Néanmoins, l'utilisation d'une amorce spécifique d'un gène dans la RT-PCR peut aider à maximiser le rendement de l'ADNc cible et à minimiser l'amplification de fond. (Papier blanc:Système amélioré de RT-PCR en une étape)

RT-PCR en deux étapes implique deux réactions séparées, commençant par la synthèse du premier brin d'ADNc (RT), suivie de l'amplification d'une partie de l'ADNc résultant par PCR dans un tube séparé. Par conséquent, la RT-PCR en deux étapes est utile pour détecter plusieurs gènes dans un seul échantillon d'ARN. La séparation des réactions RT et PCR permet d'optimiser les conditions de réaction pour chaque étape, ainsi que la flexibilité avec l'amorçage de la transcription inverse (amorces oligo (dT), hexamères aléatoires ou amorces spécifiques au gène) et la configuration PCR (par exemple, choix de l'ADN polymérase et composants PCR). Par rapport à la RT-PCR en une étape, les inconvénients de la RT-PCR en deux étapes incluent plusieurs étapes pour un flux de travail étendu, une manipulation et un traitement supplémentaires des échantillons et l'augmentation des risques de contamination et de variation des résultats.

Tableau 1. Comparaison de la RT-PCR en une étape et en deux étapes

RT-PCR en une étapeRT-PCR en deux étapes
InstallerRéaction combinée dans des conditions qui prennent en charge à la fois la transcription inverse et la PCRSéparer les réactions optimisées pour la transcription inverse et la PCR
AmorcesAmorces spécifiques aux gènesChoix d'oligo(dT), d'hexamères aléatoires ou d'amorces spécifiques à un gène
Utilisation idéaleAnalyse d'un ou deux gènes plateformes à haut débitAnalyse de plusieurs gènes
AvantagePratique, haut débitSouple

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6.5 : Réaction en chaîne par polymérase (PCR) - Biologie

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Le but de la PCR, Polymerase Chain Reaction, est d'amplifier une séquence génétique. Dans cet exemple, un gène d'intérêt sera amplifié à partir d'ADN purifié. Afin d'effectuer l'amplification, une polymérase est nécessaire pour synthétiser le nouvel ADN.

Une amorce, un court morceau d'ADN simple brin qui partage une homologie avec le gène d'intérêt est également nécessaire. Enfin, des nucléotides simples appelés désoxynucléoside triphosphates ou dNTP sont utilisés pour fabriquer le nouveau brin. La première étape de la PCR consiste à chauffer le mélange qui dénature l'ADN.

Ensuite, la réaction est refroidie et les amorces s'hybrident à leur région homologue. Une fois liée, la réaction est chauffée à une température optimale pour la polymérase. La polymérase reconnaît alors le complexe d'ADN d'amorce et commence la synthèse du nouveau brin en utilisant les dNTP dans la solution.

La réaction est ensuite chauffée et se déroule comme décrit sur des cycles supplémentaires. Après le troisième cycle, il y a huit copies totales du gène. Après le quatrième cycle, 16 exemplaires.

Et cinquième cycle, 32 exemplaires. Le nombre de cycles va continuer à croître de façon exponentielle. Après 30 cycles, il y a un peu plus d'un milliard d'exemplaires.

15h14 : PCR

Aperçu

La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est une technique largement utilisée pour copier des segments d'ADN. En raison de l'amplification exponentielle, la PCR peut produire des millions ou des milliards de copies d'ADN en quelques heures seulement.Dans une réaction PCR, une enzyme ADN polymérase résistante à la chaleur amplifie l'ADN d'origine par une série de changements de température à l'intérieur d'une machine automatisée appelée thermocycleur.

La PCR est une méthode polyvalente qui a révolutionné la biologie moléculaire

Kary Mullis a développé la PCR en 1983, pour laquelle il a reçu le prix Nobel de chimie en 1993. Étant un moyen relativement rapide, peu coûteux et précis de copier une séquence d'ADN, la PCR est devenue un outil précieux pour de nombreuses applications, notamment le clonage moléculaire, la mutagenèse de gènes, la détection d'agents pathogènes, l'analyse de l'expression génique, la quantification et le séquençage de l'ADN et le diagnostic de maladies génétiques.

Le cycle de réaction PCR

La PCR imite le processus naturel de réplication de l'ADN qui se produit dans les cellules. Le mélange réactionnel comprend une séquence d'ADN matrice à copier, une paire de molécules d'ADN courtes appelées amorces, des blocs de construction d'ADN libres appelés désoxynucléotides triphosphates (dNTP) et une enzyme ADN polymérase spécialisée.

La PCR implique une série d'étapes à haute température, nécessitant une enzyme ADN polymérase qui soit fonctionnelle à de telles températures. L'ADN polymérase la plus couramment utilisée est Taq polymérase, du nom Thermus aquatique, la bactérie à partir de laquelle la polymérase a été initialement isolée. L'ADN polymérase est incapable de synthétiser une molécule d'ADN à partir de zéro ou de novo. Au lieu de cela, l'ADN polymérase s'ajoute à de courtes molécules d'ADN, appelées amorces, qui se lient à la matrice d'ADN par appariement de bases complémentaires. Les amorces fournissent un groupe hydroxyle 3&rsquo libre auquel l'ADN polymérase peut attacher de nouveaux dNTP. Il existe quatre types de dNTP dans une PCR, un pour chaque nucléotide de la molécule d'ADN : dATP, dCTP, dGTP et dTTP.

Chaque cycle de PCR comprend trois étapes : dénaturation, recuit et synthèse d'ADN.

  1. Dénaturation. Le cycle PCR est initié en chauffant le mélange réactionnel à une température élevée, provoquant la séparation de la double hélice d'ADN en deux brins. Ce processus de &ldquomelting&rdquo se produit généralement à une température de 90°C­­&ndash100°C.
  2. Recuit. Le mélange réactionnel est rapidement refroidi (généralement à 50 °C et 65 °C), permettant aux deux amorces de se lier à leurs séquences complémentaires sur les brins d'ADN matrice.
  3. Synthèse d'ADN (Extension d'amorce). Le mélange réactionnel est à nouveau chauffé, cette fois à une température (généralement 60°C et 75°C) qui permet à l'ADN polymérase d'étendre les amorces en ajoutant des dNTP qui s'apparient aux bases du brin matrice.

Une PCR typique implique 20 à 40 cycles répétés de ces trois étapes, se produisant dans le thermocycleur. Étant donné que le nombre de molécules d'ADN est doublé à chaque cycle, l'ADN est amplifié de façon exponentielle.

Limites de la PCR

Si le scientifique souhaite amplifier un tronçon spécifique du génome, il doit connaître au moins une partie de la séquence d'ADN cible pour concevoir des amorces appropriées. Un autre problème potentiel est l'annelage non spécifique d'amorces à des séquences d'ADN partiellement similaires, conduisant à l'amplification d'ADN non cible. Ce problème peut être contrôlé en optimisant les conditions de réaction. Étant une méthode de détection très sensible, la PCR est également vulnérable à la contamination, et même des traces d'ADN contaminant peuvent entraîner des résultats trompeurs. Les ADN polymérases utilisées en PCR peuvent être sujettes à des erreurs. Si une mutation se produit au cours des premiers cycles, la plupart de l'ADN amplifié portera la mutation.

Garibyan, Lilit et Nidhi Avashia. &ldquoDes techniques de recherche simplifiées : la réaction en chaîne par polymérase (PCR).&rdquo Le Journal de la dermatologie d'investigation 133, non. 3 (mars 2013) : e6. [La source]

Pray, Leslie A. &ldquoLa révolution biotechnologique : PCR et utilisation de la transcriptase inverse pour cloner les gènes exprimés.&rdquo Éducation à la nature 1, non. 1 (2008) : 94. [Source]