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Qu'est-ce que la fuite de protons ?

Qu'est-ce que la fuite de protons ?


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J'en ai une idée. Est-ce le reflux inutile des ions H+ à travers le découplage des protéines pendant la respiration aérobie ?

Merci


Réponse courte : oui. Il comprend également des fuites non spécifiques sans l'aide de protéines de découplage, car la membrane interne mitochondriale n'est pas entièrement imperméable aux protons. Par exemple, les protons peuvent retomber à travers les complexes de pompage de protons, à travers d'autres porteurs de solutés, ou à travers d'autres ouvertures ou irrégularités dans la membrane.


La régulation et la physiologie de la fuite de protons mitochondriaux

Les mitochondries couplent la respiration à la synthèse d'ATP via un gradient électrochimique de protons. La fuite de protons à travers la membrane interne permet d'ajuster l'efficacité de couplage. L'objectif de cette revue est triple : 1) présenter au lecteur non familier la fuite de protons et sa signification physiologique, 2) revoir le rôle et la régulation des protéines de découplage, et 3) décrivent les perspectives de fuite de protons comme moyen de traiter l'obésité, le diabète et les maladies liées à l'âge.


Les espèces d'oxygène réactif mitochondrial médient l'activation des cellules endothéliales induite par la lysophosphatidylcholine

Objectif: L'activation des cellules endothéliales (CE) induite par l'hyperlipidémie est considérée comme un événement initial responsable du recrutement des monocytes dans l'athérogenèse. Cependant, il reste mal défini quel est le mécanisme sous-jacent à l'activation des CE induite par l'hyperlipidémie. Ici, nous avons testé une nouvelle hypothèse selon laquelle les espèces réactives de l'oxygène mitochondrial (mtROS) servent de médiateurs de signalisation pour l'activation de la CE dans l'athérosclérose précoce.

Approche et résultats : Les analyses métabolomiques et transcriptomiques ont révélé que plusieurs espèces de lysophosphatidylcholine (LPC), telles que 16:0, 18:0 et 18:1, et leurs enzymes de transformation, y compris Pla2g7 et Pla2g4c, étaient significativement induites dans les aortes de souris knock-out pour l'apolipoprotéine E pendant athérosclérose précoce. En utilisant la résonance de spin électronique et la cytométrie en flux, nous avons constaté que le LPC 16:0, 18:0 et 18:1 induisait des mtROS dans les CE aortiques humaines primaires, indépendamment des activités de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase. Mécaniquement, en utilisant la microscopie confocale et l'analyseur mitochondrial Seahorse XF, nous avons montré que le LPC induit mtROS via une augmentation unique de la fuite de protons et de la réduction de l'O2 mitochondrial induite par l'entrée de calcium. En outre, nous avons constaté que mtROS contribuait à l'activation des CE induite par LPC en régulant la liaison nucléaire de la protéine activatrice-1 et en induisant l'expression du gène de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 in vitro. En outre, nous avons montré que l'inhibiteur de mtROS MitoTEMPO supprimait l'activation de la CE et le recrutement des monocytes aortiques chez les souris knock-out pour l'apolipoprotéine E en utilisant des méthodes de microscopie intravitale et de cytométrie en flux.

Conclusion : L'augmentation de mtROS non couplée à la synthèse d'ATP, mais couplée à une fuite de protons, médie l'activation de la CE induite par le LPC au cours de l'athérosclérose précoce. Ces résultats indiquent que les antioxydants mitochondriaux sont des thérapies prometteuses pour l'inflammation vasculaire et les maladies cardiovasculaires.

Mots clés: athérosclérose cellules endothéliales hyperlipidémie mitochondries espèces réactives de l'oxygène.


Résultats

L'approche

Conceptuellement, les trois complexes de translocation de protons de la chaîne respiratoire (Fig. 1) fonctionnent de la même manière, bien que les mécanismes moléculaires détaillés soient très différents. Dans tous les cas, nous avons affaire à une réaction énergétiquement ascendante, endergonique ou « conduite » de translocation de protons du côté N chargé négativement au côté P chargé positivement de la membrane mitochondriale interne (définie ici comme réaction 1). Une telle réaction ne peut se produire spontanément, mais devient possible lorsqu'elle est couplée à une réaction énergétiquement descendante, exergonique ou « motrice » (réaction 2), qui est l'oxydation du NADH par l'ubiquinone (catalysée par le complexe I), l'oxydation de l'ubiquinol par le ferricytochrome c (catalysé par le complexe III) ou oxydation du ferrocytochrome c par le dioxygène (catalysé par le complexe IV), ou toute combinaison de ces trois fonctions (Fig. 1).

Les complexes protonmotives I, III et IV sont représentés dans la membrane interne, ainsi que des composants supplémentaires de la chaîne, le complexe II, le cytochrome c et l'ubiquinone (Q), les donneurs d'hydrogène NADH et succinate et l'accepteur, O2. La combinaison de N,N,N',N'-tétraméthyl-phénylène-diamine (TMPD) et d'ascorbate (non illustré pour plus de clarté, voir le texte) donne des électrons directement au cytochrome c et n'engage donc que le complexe IV. Les flèches noires représentent les transferts d'hydrogène et d'électrons dans la chaîne, réduisant éventuellement O2 arroser. Les flèches rouges symbolisent les événements protonmoteurs associés où Zm est la stoechiométrie effective du protonmoteur H + /e −, 2 pour le complexe I et le complexe IV, 1 pour le complexe III (voir « Méthodes ») et n est le nom du complexe. Différences de potentiel redox moyennes typiques (ΔE) à travers chaque complexe sont donnés. Le changement net d'énergie libre (Δg) pour toute combinaison de complexes est donnée comme la somme arithmétique de la différence de potentiel redox pertinente et de la force protonmotrice (ΔP) multiplié par la stoechiométrie H + /e − (Z), oùE a un signe négatif et est plus grand que ΔP pour le cas où la chimie redox entraîne la translocation des protons.

Traitant cela au niveau général de la thermodynamique des réactions couplées hors équilibre, on peut écrire (voir réf. 14,15,16 )

J1 et J2 sont les flux des réactions couplées, et X1 et X2 se référer aux forces correspondantes (énergies libres). Dans le cas des complexes de chaînes de transport d'électrons, cela devient :

JH est le flux de protons (négatif lorsque les protons sont pompés du côté N vers le côté P de la membrane), Je est le flux d'électrons,P est la force protonmotrice etE est la durée d'oxydoréduction ou la différence de potentiel d'oxydoréduction des porteurs d'oxydoréduction du côté donneur et accepteur de la réaction considérée. Les coefficients de couplage croisé L12 et L21 sont supposées égales, ce qu'on appelle la symétrie d'Onsager, qui est rencontrée dans de nombreuses conditions de phosphorylation oxydative (voir les références 15, 16 et ci-dessous). Pour une pompe, L11 et L22 sont négatifs et L12 et L21 sont positifs.

Il est important de noter que notre traitement de la translocation mitochondriale de protons liés par redox par les équations 1 est une simplification dans la mesure où le flux de protons, JH, sera évalué à partir du flux de protons à travers le Fo partie de l'ATP synthase conduisant à la synthèse d'ATP (voir ci-dessous). L'équation (1b) n'inclut pas explicitement le flux de protons à travers le diélectrique de la membrane (fuite de protons). Une telle fuite de protons, ainsi qu'un couplage incomplet entre les électrons et les protons dans les complexes respiratoires eux-mêmes (c'est-à-dire le « glissement de protons ou d'électrons », voir les références 7,8,9,10,11,12,13,17 et Fig. 2) , sont plutôt considérés collectivement dans le « degré de couplage » (q) des réactions 1 et 2, telles qu'elles seront définies ci-après.

La caricature montre un prototype d'un complexe redox protonmotive de la chaîne respiratoire (à gauche) et une vue schématique de la F1Fo ATP synthase (à droite), toutes deux intégrées dans la membrane phospholipidique mitochondriale interne. Les flèches rouges représentent le transfert d'électrons du réducteur à l'oxydant, qu'ils soient liés (Je P ) au pompage de protons à travers la membrane (JH P ) ou découplé de celui-ci (« glissement électronique », Je S ). JH L représente une fuite intrinsèque de protons dans le mécanisme de la pompe (« glissement de protons »). JH M signifie perte de force protonmotrice par une fuite de protons à travers la membrane. Afflux de protons à travers le Fo domaine de l'ATP synthase (JH F ) est supposé être totalement couplé à la synthèse d'ATP sans glissement significatif (voir le texte). Les aspects stoechiométriques (rapports H + /e − et H + /ATP) sont omis pour plus de clarté (mais voir le texte).

Définir les rapports des forces et des flux de sortie et d'entrée comme X (=ΔPE) et j (=JH/Je), respectivement, et la stoechiométrie mécaniste H + /e −, Z, comme la racine carrée du rapport entre les coefficients de couplage primaire débit/force, c'est-à-dire Z = (L11/L22), on obtient de l'Eq. (1) 14,15,16

q est donné par:

Le facteur q a été appelé le degré de couplage entre les processus d'entrée et de sortie 14 et varie entre 0 (pas de couplage) et 1 (couplage complet). Avec couplage complet des deux réactions (c'est-à-dire q = 1), le rapport de flux j est égal à -Z.

Le rapport j/Z, équivalent à (H + /e − )/Z, a été appelée « rendement stoechiométrique » 18 , qu'il ne faut pas confondre avec le rendement thermodynamique (cf. ci-dessous). j/Z n'est pas non plus équivalent au degré de couplage (q), sauf cas particulier où X = 0, c'est-à-dire lorsque la force de la réaction entraînée est nulle (ΔP = 0) et la réaction couplée se déroule sans charge (voir Eq. (2)). Ce cas particulier a été appelé "flux de niveau" 14,15,16, et est une condition généralement recherchée dans la plupart des méthodes de détermination expérimentale du rapport H + /e - (mais voir ci-dessous). Il est à noter qu'un tel rapport H + /e − dérivé expérimentalement (j) au niveau du débit n'est pas égal à la vraie stoechiométrie mécaniste (Z), mais à cette valeur multipliée par le degré de couplage, c'est-à-dire qZ.

La mise au point

L'un des objectifs de ce travail est d'évaluer l'efficacité thermodynamique de la translocation de protons par redox. Étant donné que le rendement thermodynamique (??) est défini comme le rapport entre les puissances de sortie et d'entrée de deux réactions couplées, et puisque la puissance est le produit du flux (J) et forcer (X) on peut écrire

où le signe négatif signifie que le flux de réaction entraîné (JH) se produit dans une direction opposée à sa force conjuguée (ΔP), c'est-à-dire que le flux net de protons est dominé par le pompage plutôt que par la fuite. D'après les définitions antérieures des rapports d'écoulement et de force (j et X), cette équation se simplifie en

Ainsi le rendement thermodynamique (??) de l'ensemble de la chaîne de transport d'électrons s'approche de zéro dans les mitochondries de l'état 4 car le pompage de protons est égal à la fuite de protons de sorte que le flux net de protons (J F H, Fig. 2) se rapproche de zéro. Cependant, chaque complexe individuel de pompage de protons pourrait encore fonctionner à haute efficacité dans l'état 4, mais l'énergie transduite par les pompes à protons est dissipée par fuite à travers la membrane. Dans l'état totalement découplé, également appelé flux de niveau 14,15,16 , la force protonmotrice (c'est-à-dire l'énergie de sortie, X1) se rapproche de zéro et donc ?? est également nul. De toute évidence, l'efficacité maximale de la réaction globale est atteinte quelque part entre la hauteur statique et le débit de niveau (Fig. 3, pour plus de détails, voir ci-dessous). Dans un modèle mathématique de la pompe à protons du cytochrome c oxydase, Kim et Hummer 19 ont trouvé une dépendance en forme de cloche très similaire de l'efficacité thermodynamique sur la force protonmotrice que celle théorique montrée sur la figure 3.

La figure représente la dépendance de l'efficacité (??) sur le rapport entre les forces de sortie (protonmotrice) et d'entrée (oxydoréduction) normalisées par la stoechiométrie mécaniste (idéale) H + /e − (Z) (voir aussi réf. 14 ), selon l'Eq. (4), pour quatre degrés de couplage différents (q) tel que défini par l'Eq. (7). Des exemples de courbes ne sont donnés que pour le cas « montant » où la réaction redox entraîne la translocation de protons. Les fines lignes bleues montrent la plage approximative des rapports de force et des efficacités observées dans l'état 3 des mitochondries isolées du foie de rat (voir le tableau 1). La zone couverte par les données est indiquée par un rectangle bleu.

Etat 3, où l'excès d'ADP et de phosphate inorganique (Pje) prend en charge un taux élevé de respiration 6 et la synthèse concomitante d'ATP entraînée par le ΔP, se situe entre la hauteur de chute statique et le débit de niveau et est donc le seul état raisonnablement bien défini de mitochondries isolées convenant à la détermination de l'efficacité thermodynamique.

Détermination de l'efficacité à l'aide de l'Eq. (5) nécessite la connaissance du rapport de force dans l'état 3 (X), qui peuvent être calculés à partir des données de la littérature où l'équilibre redox du NAD + /NADH, ubiquinone/ubiquinol, ferri-/ferrocytochrome c et des couples redox oxygène/eau ont été rapportés 20 . Cependant, le rapport de flux (j) (c'est-à-dire le rapport H + /e −) ne peut pas être mesuré directement dans l'état 3. Heureusement, nous avons accès à une méta-analyse de la quantité d'ATP formée par électrons transférés (l'ATP/2e − ou P/ O ratio) dans les différents domaines de la chaîne respiratoire mitochondriale dans l'état 3 21 . De telles données ATP/2e − peuvent être converties en rapports H + /2e − (qui sont deux fois les rapports de flux, j) par la relation

où H + /ATP, c'est-à-dire le nombre de protons transloqués du côté P vers le côté N de la membrane interne par molécule d'ATP synthétisée, est de 3,67 dans les mitochondries animales pour le cas de l'ATP produit de manière extramitochondriale. En raison des huit sous-unités c de la structure en anneau membranaire de l'ATP synthase dans les mitochondries animales, huit protons sont transloqués par rotation complète avec la synthèse conséquente de trois molécules d'ATP 22, donnant 8/3 ou 2,67 H + /ATP. Translocation supplémentaire de l'ATP formé dans l'espace extramitochondrial, en échange d'ADP et de Pje en sens inverse, se déroule respectivement sur les transporteurs ADP/ATP et phosphate, en échange de la translocation d'un proton supplémentaire 22 .

Il est essentiel de noter que le rapport de flux, j, évalué par cette méthode, ne mesure que le flux de protons productif utilisé pour la synthèse d'ATP (voir Fig. 2 et ci-dessous).

Afin de déduire le degré de couplage (q) dans les mitochondries de l'état 3, il ne suffit pas de connaître la stoechiométrie mécaniste (Z) et le rapport H + /e − (j). Comme mentionné ci-dessus, q = j/Z uniquement dans le cas particulier où il n'y a pas de charge, c'est-à-dire où X = 0. Les mitochondries de l'état 3 ne fonctionnent pas au niveau du débit (ΔP = 0), mais à un rapport de force considérable (X)P est souvent env. 170 mV 7,8,9,10,13,23 . Il faut donc résoudre l'équation. (3) en ce qui concerne q, cédant

Alors que le degré de couplage (q) peut être considéré comme une constante dans ce traitement, le rapport H + /e − (c'est-à-dire le rapport de flux j) ne l'est pas, mais diminue avec l'augmentation de la charge (X) à partir de sa valeur maximale de qZ à charge nulle 14,15,16 .

Efficacité thermodynamique

Le tableau 1 montre les données obtenues pour les trois complexes redox dans des mitochondries isolées de l'état 3, soit fonctionnant ensemble, soit évalués séparément (voir « Méthodes »). Pour comparaison entre les trois complexes redox, le rapport de force (X) est normalisée par multiplication avec la stoechiométrie mécanique H + /e −, Z, qui vaut 2, 1 et 2, respectivement pour les complexes I, III et IV (voir « Méthodes »), et le rapport de flux (j) est normalisée par division avec Z. Les données pour les complexes individuels ont été obtenues comme suit (voir Fig. 1). L'ATP/2e − pour le complexe I a été pris comme la différence entre les rapports moyens avec les substrats liés au NADH et le succinate. Le rapport pour le complexe IV était basé sur l'ATP/2e - moyen avec l'ascorbate TMPD+ comme substrat. Le rapport pour le complexe III était basé sur la différence entre les rapports ATP/2e − avec le succinate et l'ascorbate TMPD+ comme substrats.

Comme le montre le tableau 1, le rendement thermodynamique calculé (??) varie entre

67 et 87 %, le plus élevé étant l'efficacité du complexe I. Deux ensembles de données sont répertoriés pour le complexe IV, ce qui est expliqué dans la section suivante.

Le cas particulier du complexe IV (cytochrome c oxydase)

Le traitement conventionnel des données du complexe IV (tableau 1, données entre parenthèses) indique que l'enzyme terminale de la chaîne respiratoire aurait de loin l'efficacité de transduction énergétique la plus faible, 67%, par rapport aux efficacités du complexe III (78%) et complexe I (87%). On peut soupçonner que cela est lié au fait que la réaction complexe IV globale est irréversible, de sorte que la génération d'O2 de l'eau n'est pas possible car entraîné par la force protonmotrice. Cependant, l'élucidation du mécanisme de la catalyse IV complexe 1,24 a révélé que l'irréversibilité est le résultat d'une rupture irréversible de la liaison O–O dans l'étape de réaction partielle en raison du grand Δg 0 , où l'intermédiaire A lié à l'oxygène est converti en intermédiaire P (voir réf. 25 , Fig. 4), une réaction qui n'est couplée ni au pompage de protons ni au transfert transmembranaire d'électrons ou de protons 1,24 . La liaison d'O2 à l'intermédiaire R est entièrement réversible 26,27, et le plus important, toutes les quatre autres réactions partielles du cycle catalytique sont couplées à la translocation de protons 1,24, et se sont en effet avérées être inversées par la force protonmotrice 28 .

Le centre binucléaire est représenté par un rectangle, composé d'hème une3 (Fe) le Cu à proximitéB (Cu) et la tyrosine conservée (tyr-OH, tyrosine tyr-O − , tyrosinate tyr-O*, radical tyrosine neutre) liée de manière covalente à l'un des trois ligands histidine de CuB. Les trois ligands histidine de CuB et l'histidine proximale de l'hème une3 ne sont pas représentés pour plus de clarté. Le nom de chaque état intermédiaire se trouve à l'extérieur du coin droit de chaque rectangle. Les flèches rouges spécifient les réactions qui impliquent chacune un transfert d'électrons vers le site à partir de l'hème de faible spin une, transfert net d'un proton substrat du côté N de la membrane pour terminer la chimie de réduction de l'oxygène, et absorption (du côté N) et libération (vers le côté P) d'un autre proton (c'est-à-dire pompage de protons). Par conséquent, les flèches rouges indiquent des réactions d'oxydoréduction partielles qui sont réversibles à élevéP. La flèche bleue représente l'étape de réaction partielle irréversible où la liaison O–O de O2 est rompu dans une réaction non liée à la transduction d'énergie. Notez que l'intermédiaire classique "ferreux-oxy" A 26 est plus précis décrit comme un état ferrique-superoxyde d'hème une3 5 .

L'irréversibilité du cytochrome global c La réaction de l'oxydase ne doit donc pas être interprétée comme suggérant un couplage lâche de la chimie redox à la translocation de protons. Afin de concentrer l'analyse sur ces étapes de réaction couplées, nous avons soustrait le changement d'énergie libre de l'étape de réaction irréversible A → P (Fig. 4 environ 5 kcal/mol 25 ) de la force motrice standard globale. Dans l'analyse de base (tableau 1, données entre parenthèses), nous avons supposé une concentration moyenne de O2 de 120 M dans le calcul de la force motrice. Cependant, comme le montrent Wilson et al. 29 , le potentiel redox du donneur, cytochrome c, n'est pas abaissé (cyt. c ne diminue pas davantage) à l'état d'équilibre jusqu'à ce que la concentration en oxygène soit abaissée en dessous d'env. 10 M. Nous avons donc ajusté le potentiel redox de l'O2/2H2O couple à 12 μM O2 pour obtenir une meilleure estimation de l'efficacité réelle.Comme le montre le tableau 1, ces deux changements augmentent le rendement thermodynamique de 67 % à 77 %, entièrement en raison du changement du rapport de force. Nous concluons que l'efficacité thermodynamique moyenne des éléments réels de la pompe à protons du complexe IV (flèches rouges sur la figure 4) est tout à fait comparable à celles des autres complexes, et que l'efficacité globale inférieure de la fonction du complexe IV est causée par l'étape irréversible de rompre la liaison O–O qui n'est pas couplée à la génération de force protonmotrice.

Le degré de couplage

Le tableau 1 montre les résultats pour le degré de couplage (q) calculé pour l'état 3 selon l'éq. (7). L'essentiel ici est que le degré de couplage soit très élevé pour les trois complexes de la chaîne respiratoire q est bien au-dessus de 0,99. De ce fait, le rapport de force de sortie/entrée normalisé (Zx) dans l'état 3 donne une bonne approximation de l'efficacité thermodynamique (voir les équations (2) et (5)), ce qui donne du crédit à l'utilisation de ce rapport comme indicateur d'efficacité (par exemple, réf. 30 ). Le degré de couplage est assez insensible à la force protonmotrice dans l'état 3, supposée ici de 170 mV (voir ci-dessus). Si leP étaient plus élevés, le degré de couplage serait encore plus élevé que dans le tableau 1. S'il était de 150 mV, le degré de couplage pour l'oxydation du succinate (complexes III + IV), par exemple, ne tomberait qu'à 0,992.

Le très haut degré de couplage (q > 0,99) trouvées ici à partir des données de phosphorylation des mitochondries (état 3) peuvent sembler être en contraste frappant avec les conclusions faites plus tôt sur la base de la dépendance des fréquences respiratoires mitochondriales sur le potentiel membranaire. Par exemple, Hinkle et al. 23 ont trouvé que le taux de respiration de l'état 4, mesuré au même potentiel membranaire que dans l'état de phosphorylation 3, était une fraction considérable du taux de respiration de l'état 3. La perte d'énergie évaluée de cette manière était de près de 4 % avec le succinate comme substrat. (activité du complexe III + IV) et

7% pour le complexe IV seul (voir aussi « Discussion »). Cependant, les rapports de flux (H + /e − ) dans l'état 3 observés ici étaient de 0,95 à 0,98 après normalisation à Z (Tableau 1), suggérant une perte de 2 à 5 % due aux fuites, ce qui est cohérent avec les données susmentionnées. Il convient de souligner que tant que le degré de couplage n'est pas idéal (c'est-à-dire q < 1), le rapport de flux est lié à diminuer avec l'augmentation du rapport de force 14,15,16. Comme déjà conclu ci-dessus, j est égal à qZ seulement à X = 0, c'est-à-dire au niveau d'écoulement lorsque la force protonmotrice est nulle.

Les réactions couplées sont proches de l'équilibre

??g désigne le changement d'énergie libre de la réaction couplée de translocation de protons liée à l'oxydoréduction pour l'un des trois complexes protonmoteurs ou leur combinaison, c'est-à-dire

Le span redox pour les différents complexes de la chaîne respiratoire (X2, ouE) peut être obtenu à partir de la littérature comme précédemment (tableau 2 20,31 ). Pour l'état 3, nous avons supposé un pmf de 170 mV (voir ci-dessus), et cela donne un changement d'énergie libre d'environ. -44 mV pour les complexes I et III, ce qui correspond à

−1 kcal/mol, montrant que même dans l'état 3, ces complexes fonctionnent assez près de l'équilibre thermodynamique. Le complexe IV semble moins réversible, mais lorsque la séparation irréversible de la liaison O–O est soustraite et que l'O2 concentration ajustée aux niveaux physiologiques (voir ci-dessus), la variation d'énergie libre moyenne des réactions qui entraînent réellement le transfert transmembranaire de protons n'est que de l'ordre de -1,8 kcal/mol (-78 mV).

Les valeurs pour l'état 4 sont également répertoriées dans le tableau 2. En l'absence d'une valeur expérimentale pour ΔP dans les expériences Muraoka & Slater 20 , nous l'avons estimé comme suit. Nous avons collecté les cas où la respiration a été étudiée avec du succinate et avec du TMPD + ascorbate comme substrats 20 , où il n'y a pas ou très peu de flux d'électrons net à travers le complexe I. Au lieu de cela, le généréP repousse les électrons du cytochrome c et ubiquinone à NAD + jusqu'à ce qu'un état d'équilibre soit atteint, dans lequel les réactions redox du complexe I devraient s'équilibrer avec le ΔP. Dans ces conditions, nous avons trouvé queE à travers le complexe I était de 373 et 374 mV, respectivement, c'est-à-dire correspondant à unP de 187 mV, ce qui semble être une très bonne approximation pour les mitochondries isolées de foie de rat en présence de 10 mM de phosphate inorganique 7,9. En utilisant cette valeur pour leP, nous trouvons que le complexe I fonctionne en effet très près de l'équilibre thermodynamique dans l'état 4 lors de l'oxydation des substrats liés au NAD. En revanche, les complexes III et IV s'écartent davantage de l'équilibre (tableau 2 voir ci-dessous).

Le degré de couplage est-il constant ?

L'état 4 (tête statique) est défini comme l'état où la génération nette de ΔP (J1) disparaît. Si j est nul dans l'équation. (2), alors le numérateur du membre de droite doit être zéro, d'où résulte que le rapport de force, X =PE, est une fonction directe du degré de couplage 14,15,16 , tel que

Il s'agit d'une simplification car toute fuite de protons à travers la membrane 7,8,9,10 garantira que la génération nette de ΔP (J1) par les complexes de pompage se produit toujours à un débit déterminé par cette fuite. Cependant, dans les mitochondries bien couplées la fuite est lente par rapport aux flux aller et retour dans la chaîne respiratoire, de sorte que les réactions redox des complexes respiratoires restent assez proches de l'équilibre avec la force protonmotrice dans l'état 4, et même dans l'état 3 (Tableau 2).

En appliquant l'éq. (9) aux données de l'État 4 (tableau 2) suggère que q est de 0,99 pour le complexe I, mais seulement de 0,84 et de 0,90 pour les complexes III et IV, respectivement, même si ce dernier est ajusté pour l'irréversibilité de la rupture de la liaison O–O et évalué à 12 μM O2, comme décrit ci-dessus. Valeurs de q significativement plus petits que 0,99 ont été signalés auparavant pour les mitochondries isolées 15, mais ils ont également été basés sur l'Eq. (9) et la situation de l'État 4.

Ce résultat suggère une approche proche de l'équilibre thermodynamique entre la réaction d'oxydoréduction du complexe I et sa translocation de protons associée dans l'état 4, et donc que le degré de couplage est proche de l'unité comme il s'est avéré être dans l'état 3 (tableau 1). En revanche, le degré de couplage pour les complexes III et IV semble être clairement abaissé par rapport à la valeur trouvée dans l'état 3, c'est-à-dire pendant la phosphorylation oxydative active.


MITOCHONDRIE ISOLÉE

Flux : courant protonique mitochondrial (taux de respiration)

La mesure du courant protonique est généralement plus informative que la mesure de la pmf si un seul doit être mesuré (mais il est préférable de connaître les deux). De la même manière, il est plus instructif de connaître le courant prélevé sur le réseau électrique par vos appareils électroménagers que de connaître la chute de tension aux bornes de votre coffret électrique.

Le couplage étroit entre le transport d'électrons et l'extrusion de protons dans les mitochondries et les cellules [35-37] signifie que pour un substrat donné, le taux d'utilisation de l'oxygène mitochondrial est une mesure précise du courant protonique total. Ce taux mesure l'activité d'un seul processus : le transfert au sein du complexe IV de quatre électrons à une molécule d'oxygène pour générer deux molécules d'eau. Malgré cette limitation apparente, des expériences peuvent être conçues pour obtenir des informations sur une grande variété de processus, y compris le transport de substrat dans la cellule, le métabolisme cytoplasmique, le transport dans la mitochondrie, le métabolisme mitochondrial, la livraison d'électrons à la chaîne respiratoire, les activités du complexe I ou II, complexe III, complexe IV, synthèse d'ATP, fuite de protons, exportation d'ATP vers le cytoplasme et utilisation de l'ATP cellulaire. L'art d'utiliser la respiration pour découvrir un dysfonctionnement dans une grande variété de modules et de réactions réside dans la conception d'expériences qui déplacent le contrôle sur cette réaction afin que le dysfonctionnement soit plus facilement reconnu et quantifié. L'électrode à oxygène de Clark est utilisée depuis 50 ans pour mesurer la respiration mitochondriale [38], mais d'autres méthodes, telles que les tests de fluorescence sur plaque [39,40], peuvent fournir les mêmes informations.

Contrôle respiratoire mitochondrial : la meilleure mesure générale de la fonction mitochondriale dans les mitochondries isolées

Les expériences classiques d'électrodes à oxygène pour déterminer la fonction bioénergétique mitochondriale ont été conçues par Chance et Williams [38]. Le substrat est ajouté à une incubation mitochondriale, suivie d'une petite quantité d'ADP, permettant à l'ATP synthase de fonctionner, de laisser tomber les pmf et d'accélérer le transport des électrons (état 3ADP'). Lorsque le rapport ATP/ADP approche de l'équilibre, la pmf augmente, la rentrée des protons à travers la synthase s'arrête et la respiration ralentit (« état 4 »). En pratique, la présence d'ATP dans l'incubation peut avoir des effets supplémentaires dans l'état 4. Toute activité contaminante de l'ATPase (par exemple mitochondries brisées avec des ATPases découplées ou des fibres musculaires résiduelles dans une préparation mitochondriale musculaire) empêchera le rétablissement d'une respiration faible. Pour cette raison, l'état 3ADP la respiration peut être interrompue en ajoutant l'oligomycine inhibiteur de l'ATP synthase pour atteindre un « état 4o » (« état 4oligomycine’), auquel le recyclage de l’ATP ne peut pas contribuer. L'ajout d'oligomycine peut être suivi d'une concentration soigneusement titrée d'un protonophore, tel que le FCCP (carbonyl cyanure p-trifluorométhoxyphénylhydrazone), pour donner une respiration non couplée (‘état 3FCCP' ou 'état 3u'). Dans certaines mitochondries, comme celles de la graisse brune où l'activité de l'ATP synthase est très limitée, l'état 3u peut être beaucoup plus élevé que l'état maximal 3ADP [41].

Deux paramètres « pré-chimiosmotiques » sont encore utilisés pour quantifier le comportement des mitochondries dans cette expérience classique : le RCR mitochondrial [rapport de contrôle respiratoire (état 3/état 4)], défini comme la respiration à l'état 3ADP divisé par celui de l'état 4, et le rapport P/O, mole d'ATP synthétisée par mole de O ( 1 /2O2) utilisé. À de rares exceptions près, telles que les mitochondries de graisse brune dont la protéine de découplage est activée par l'acide gras [42], les mitochondries « saines » dans des conditions d'incubation correctement conçues montrent un contrôle respiratoire élevé : une forte augmentation de la fréquence respiratoire avec l'ADP suivie d'un retour à l'état 4 Le contrôle respiratoire mitochondrial encapsule la fonction principale des mitochondries : leur capacité à ralentir à un faible taux tout en répondant à l'ADP en produisant de l'ATP à un taux élevé. Un RCR élevé implique que les mitochondries ont une grande capacité d'oxydation du substrat et de renouvellement de l'ATP et une faible fuite de protons. Cependant, il n'y a pas de valeur RCR absolue qui permette de diagnostiquer des mitochondries dysfonctionnelles, car les valeurs dépendent du substrat et des tissus. Le contrôle respiratoire mitochondrial est une fonction complexe dont la valeur dépend de nombreux facteurs, et cette complexité est sa principale force : un changement dans presque tous les aspects de la phosphorylation oxydative modifiera le RCR.

État 3ADP est contrôlée à peu près également (selon le tissu et les conditions) par l'activité de renouvellement de l'ATP (principalement l'adénine nucléotide translocase, le transporteur de phosphate et l'ATP synthase) et l'oxydation du substrat (y compris l'absorption du substrat, les enzymes de transformation, les complexes de chaîne de transport d'électrons pertinents, tailles des pools d'UQ (ubiquinone) et de cytochrome c, et [O2]) (Figure 2C). L'inhibition de l'un de ces processus diminuera le taux de l'état 3.

L'état 3u est contrôlé exclusivement par l'oxydation du substrat et détectera un dysfonctionnement dans les composants de la chaîne respiratoire, les translocases du substrat ou les déshydrogénases. Différents substrats permettent de sonder de multiples voies métaboliques ou complexes respiratoires.

L'état 4 est contrôlé principalement par la fuite de protons et toutes les ATPases contaminantes qui recyclent l'ATP synthétisé sous forme d'ADP (et dans une faible mesure par l'activité d'oxydation du substrat) (figure 2C).

L'état 4o est contrôlé par l'activité de la fuite protonique (et environ 10 % par l'oxydation du substrat). Un taux de 4o à l'état bas indique que les mitochondries maintiennent un pmf suffisamment élevé pour restreindre le transport d'électrons (voir la courbe « oxydation du substrat » sur la figure 2B, où le pmf doit être >100-120 mV pour ralentir le taux de respiration). Un taux d'état 4o plus élevé indique une fuite des protons altérée in vivo ou des techniques d'isolement inappropriées qui induisent une fuite de protons artéfactuelle.

Ainsi les RCR, soit en état 3ADP/état 4 ou, dans une moindre mesure, état 3u/état 4o, sont fortement influencés par presque tous les aspects fonctionnels de la phosphorylation oxydative, ce qui en fait de bons indicateurs de dysfonctionnement. Cependant, les taux sont très sensibles aux erreurs de mesure si le système d'électrodes utilisé présente une rétrodiffusion importante d'oxygène à partir de la barre d'agitation en téflon (qui peut contenir la moitié de l'oxygène en suspension) ou du récipient ou de l'atmosphère environnante, état 4 peuvent être considérablement sous-estimés, ce qui entraîne certaines des valeurs apparentes très élevées de RCR trouvées dans la littérature. Le test pour cela consiste à répéter le cycle état 3/état 4 pour s'assurer que le RCR reste le même à une tension d'oxygène inférieure, ou pour inhiber complètement la respiration et vérifier une dérive vers le haut.

Les substrats qui alimentent en électrons le pool UQ, tels que le succinate (et le phosphate de glycérol dans les tissus appropriés), transfèrent moins de protons par paire d'électrons que les substrats liés au NADH, de sorte que le même taux de cycle de protons nécessite un taux de respiration plus élevé. Cela n'affecte pas le RCR, car l'état 3 et l'état 4 changent du même facteur. Cependant, le RCR a tendance à être plus faible avec ces substrats car ils génèrent un pmf plus élevé, pour des raisons cinétiques et thermodynamiques. Étant donné que le taux de fuite de protons dépend de la tension [22] (voir la courbe de «fuite de protons» sur la figure 2B), cela augmente le taux de l'état 4 sans changement dans la fuite de protons. De plus, dans des conditions d'incubation identiques, des RCR très différents peuvent être observés avec des mitochondries de différents tissus, reflétant des cinétiques d'oxydation du substrat différentes et des rôles physiologiques différents de la fuite de protons endogène [43].

En conclusion, le rapport de contrôle respiratoire est la mesure générale la plus utile de la fonction dans les mitochondries isolées. Un RCR élevé indique un bon fonctionnement et un RCR faible indique généralement un dysfonctionnement. L'utilité du RCR repose sur sa complexité : pratiquement tout changement dans la phosphorylation oxydative modifiera le RCR. Si les taux absolus et le RCR ne sont pas affectés par un traitement, il est sûr d'affirmer qu'il n'y a pas de dysfonctionnement bioénergétique global manifeste dans les mitochondries isolées. Une fois qu'un dysfonctionnement du RCR a été identifié et que ses causes immédiates ont été déterminées (le changement de taux d'état 3 ou d'état 4 ?), d'autres expériences seront nécessaires pour identifier les causes principales, en utilisant des analyses cinétiques modulaires ou des tests d'activité candidats.

La fréquence respiratoire absolue peut donner des indications utiles sur le mécanisme du dysfonctionnement

Un indicateur simple de la fonction des mitochondries isolées est leur taux de respiration absolu, normalisé par rapport aux protéines ou au cytochrome. une, à l'état 3ADP ou état 3u. Une chaîne de transport d'électrons endommagée peut être incapable de supporter des taux de respiration élevés si, par exemple, un cytochrome important c a été perdu de l'espace intermembranaire en raison de dommages à la membrane externe. De petits changements dans le taux de respiration absolu peuvent être causés par des changements de pureté qui peuvent ne pas être directement liés à un dysfonctionnement mitochondrial. Une fois le RCR déterminé, les taux de respiration absolus sont un moyen utile pour mieux comprendre le(s) site(s) du dysfonctionnement : le contrôle respiratoire est-il diminué en raison d'un taux plus bas de l'état 3u (dysfonctionnement localisé à l'oxydation du substrat) ou seulement du taux de l'état 3 ( dysfonctionnement de la synthèse d'ATP), ou en raison d'un taux plus élevé à l'état 4o (dysfonctionnement de la conductance protonique) ou uniquement à l'état 4 (dysfonctionnement par contamination par l'ATPase) ? Si l'état 3u est bas, est-il bas pour tous les substrats (défaut du complexe IV) ou seulement pour des substrats particuliers (par exemple le complexe II si seule l'oxydation du succinate est compromise) ?

Ratio P/O : un mauvais rapporteur de dysfonctionnement mitochondrial

Le rapport P/O est le nombre maximal de molécules d'ATP produites lorsqu'une paire d'électrons passe le long de la chaîne respiratoire du substrat à l'oxygène. C'est la stoechiométrie H + /O de la respiration divisée par la stoechiométrie H + /ATP de la synthèse d'ATP, et est donc une constante mécaniste pour tout substrat particulier. Sa valeur ne changera pas en cas de dysfonctionnement à moins que le mécanisme de couplage lui-même ne soit modifié (par exemple, les complexes respiratoires glissent et pompent moins de protons que la normale). Les rapports de la littérature sur les rapports P/O modifiés reflètent presque toujours des modifications de la correction de la fuite de protons lorsque les taux d'état 3 et d'état 4 changent, il est donc préférable de signaler ces taux et le RCR directement.

Le rapport P/O effectif (ou efficacité de couplage) est une valeur empirique qui ne corrige pas la fuite de protons, mais rapporte les flux relatifs à travers les voies de l'ATP synthase et de la fuite de protons [44]. L'efficacité de couplage près de l'état 4 est sensible aux changements dans la fuite des protons et le renouvellement de l'ATP, et est une mesure utile dans les cellules intactes (voir ci-dessous).

Forces : pmf mitochondriale

Dans l'analogue électrique du circuit à protons, l'électrode à oxygène correspond au compteur d'électricité surveillant la consommation totale de courant par les appareils d'une maison : allumez la télévision et le courant augmente. Nous ne surveillons normalement pas la tension secteur séparément car la chute de tension lorsque vous allumez le téléviseur est faible. La variable équivalente dans le circuit protonique, pmf, est moins constante, diminuant légèrement (de 10 à 20 %) pendant une transition d'état 4 à 3 ou lorsque Ca 2+ s'accumule ou augmentant légèrement lorsque l'alimentation en substrat est augmentée [45]. La surveillance de la pmf, idéalement en parallèle de la respiration, peut aider à lever l'ambiguïté. Par exemple, un traitement pourrait augmenter la respiration de l'état 4 par stimulation du découplage ou de la synthèse d'ATP, ou par une disponibilité accrue du substrat pmf, surveillé en parallèle, peut distinguer le premier (dépolarisant) et le second (hyperpolarisant).

Le pmf a deux composantes : le potentiel membranaire (Δψm) et gradient de pH (ΔpH) (éqn 1). Bien que Δψm est toujours dominant, dans des conditions extrêmes (mitochondries appauvries en phosphate accumulant Ca 2+ ), ΔpH peut contribuer à 50 % de la pmf. Alternativement, ΔpH est nul dans un milieu à base de KCl en présence de l'ionophore K + /H + nigéricine. L'utilisation prudente de la nigéricine simplifie les expériences avec des mitochondries isolées en permettant à pmf d'être assimilé à Δψm, bien que pour les études qualitatives en présence de phosphate, les changements de Δψm ont tendance à être parallèles à des changements similaires, mais plus petits, de pH [45].

Contrairement à l'électrophysiologie cellulaire, où les cellules individuelles peuvent être patchées ou pénétrées par des électrodes pour la détermination directe du potentiel membranaire, des techniques indirectes doivent être utilisées pour les mitochondries beaucoup plus petites. ??m est estimée en suivant la répartition des cations monovalents permanents membranaires (C + ) entre le milieu d'incubation et la matrice mitochondriale suivant l'équilibre de Nernst (éqn 2) :

Typique Δψm des valeurs de 150 à 180 mV correspondent à une accumulation de 300 à 1 000 fois. La relation logarithmique dans l'équation (2) signifie que les signaux sont sensibles à de petits changements de potentiel, mais que les erreurs dans l'estimation des faibles potentiels peuvent être importantes.

Valeurs absolues raisonnablement précises dem peut être obtenu en déterminant l'accumulation de cations et le volume de la matrice avec correction du coefficient d'activité apparent du cation. Le volume de la matrice peut être estimé en suspendant les mitochondries dans un milieu contenant 3 H2O et [ 14 C] saccharose, centrifugation et détermination du volume perméable à l'eau et imperméable au saccharose du culot [46]. Un volume typique est de 0,5 à 1 l par mg de protéine mitochondriale. Plus commodément, le coefficient de liaison apparent de la sonde dépend souvent du volume de la matrice, donc Δψm peut être calculé à l'aide d'une correction de liaison prémesurée en fonction du volume qui permet une mesure de routine de Δψm sans avoir besoin de mesurer le volume de la matrice ou de supposer qu'il reste constant au cours d'une expérience [47,48].

Une technique courante pour surveillerm est d'équilibrer les incubations mitochondriales avec de faibles concentrations de cations lipophiles perméables à la membrane, tels que TPP + (ion tétraphénylphosphonium) ou TPMP + (ion triphénylméthylphosphonium), et de quantifier l'absorption des cations à partir de la diminution de la concentration du milieu surveillée par un macro externe -électrode [48,49]. Des cations membranaires permanents qui possèdent une absorbance ou une fluorescence distinctive sont également utilisés. La méthode la plus courante consiste à suspendre les mitochondries dans une cuvette agitée ou une plaque multipuits à température régulée et à déterminer le changement de transmission ou d'émission totale de l'incubation en réponse aux effecteurs du potentiel membranaire. Les cations sont employés dans une plage de concentration suffisante pour entraîner une agrégation et une extinction de la fluorescence au sein de la matrice, et par conséquent le signal total de la cuvette diminue en fonction de l'accumulation de la matrice, et donc Δψm. La réponse fluorescente est généralement calibrée en parallèle en faisant varier le [K + ] externe en présence de valinomycine et en appliquant l'équation de Nernst en supposant un [K + ] interne constant [50]. Il existe des relations abruptes entre pmf et les flux à travers les trois modules de phosphorylation oxydative à des valeurs physiologiques de pmf (figure 2B), de sorte que de grands changements dans la respiration sont associés à des changements plutôt faibles dans pmf. Bien que la pmf rende compte de l'état bioénergétique, elle est moins sensible aux changements de fonction et moins utile en général que les mesures des fréquences respiratoires. Cependant, la combinaison de pmf et de taux de respiration est beaucoup plus puissante et informative que la mesure de l'un ou de l'autre seul.

Analyse cinétique modulaire

La mesure quantitative du courant protonique et de la pmf permet une analyse cinétique modulaire, permettant une description complète et quantitative de tout changement de fonction et de ses sites d'action primaire et secondaire. Par exemple, un rôle important du quantitatif Δψm la détermination, en combinaison avec la respiration, consiste à détecter et à mesurer des changements subtils dans la fuite de protons et l'efficacité du couplage entre les préparations mitochondriales. Dans le circuit électrique équivalent (figure 1), la conductance d'un composant est définie en utilisant la loi d'Ohm comme le courant par unité de différence de potentiel. Une approche similaire a été utilisée pour quantifier la conductance protonique de la membrane interne mitochondriale. ??m (ou mieux, pmf) est déterminée en parallèle avec la respiration, généralement avec de l'oxygène et des électrodes TPMP + insérées dans la même incubation. En l'absence de synthèse nette d'ATP, cela permet de calculer la conductance protonique basale de la membrane [21,45] qui est non ohmique, augmentant de manière disproportionnée à haute pmf [19,51]. Pour obtenir la plupart des informations sur la fuite de protons, il est donc nécessaire de générer un tracé courant/tension de la conductance sur une plage de potentiels, en commençant à l'état 4 et en limitant progressivement le transport des électrons, par exemple en titrant le malonate dans une mitochondrie isolée d'incubation oxydante. succinate et déterminant simultanément la respiration et la pmf [19,22] ou Δψm avec une électrode TPMP en présence de nigéricine [33,52] (la courbe de « fuite de protons » sur la figure 2B). Cette analyse cinétique modulaire peut ensuite être répétée pour les deux autres modules de phosphorylation oxydative (oxydation du substrat et renouvellement de l'ATP), donnant une image complète de l'état fonctionnel des mitochondries (figure 2B).

L'analyse cinétique modulaire décrit pleinement (au niveau du système) tout changement fonctionnel dans la phosphorylation oxydative. Une fois qu'un dysfonctionnement est découvert en mesurant le RCR et les taux de respiration absolus, l'analyse cinétique modulaire est la méthode de choix pour découvrir les causes primaires et secondaires de ce dysfonctionnement.

Concentrations et activités des complexes et enzymes candidats

Une approche très courante pour traiter le dysfonctionnement bioénergétique mitochondrial consiste à mesurer l'expression, la concentration ou l'activité maximale de quelques complexes de transport d'électrons ou enzymes métaboliques candidats, tels que le complexe I, le complexe IV ou les enzymes du cycle de l'acide tricarboxylique. L'une des raisons de la popularité de l'approche candidate est la facilité avec laquelle des transcrits spécifiques peuvent être dosés dans des puces à ADN, des protéines spécifiques peuvent être dosées à l'aide de la technologie des anticorps et des activités enzymatiques spécifiques peuvent être dosées à l'aide de kits commerciaux. L'hypothèse implicite est que ces protéines contrôlent la fréquence respiratoire et la fonction bioénergétique, donc si elles sont altérées, la fonction doit être altérée, et si elles ne sont pas altérées, la fonction doit être intacte. Ceci est incorrect pour deux raisons. Premièrement, le contrôle du taux de renouvellement de l'ATP ou d'oxydation du substrat dans les mitochondries isolées est largement partagé, aucune enzyme n'étant limitante, et la distribution du contrôle change à mesure que les conditions changent (par exemple, figure 2C). Il se peut que le candidat ait un contrôle important dans les conditions choisies et qu'une modification de son activité signale correctement un dysfonctionnement bioénergétique. Cependant, il est tout aussi probable que des changements modérés d'activité du complexe candidat aient peu d'effet sur le comportement global du système, conduisant à des faux positifs. Deuxièmement, la fonction dépend de l'intégrité de nombreux processus, de sorte que même les étapes qui n'ont aucun contrôle dans des conditions normales peuvent devenir fortement contrôlantes si elles sont compromises. L'omission de ces étapes de la liste des candidats conduira à de faux négatifs.

Autres fonctions et dysfonctionnements spécifiques

Le choix du dysfonctionnement à mesurer dépend de la question particulière posée. Les fonctions spécialisées des mitochondries comprennent le cycle de l'urée, le cycle de l'acide γ-aminobutyrique, le métabolisme des acides aminés, le métabolisme à un carbone, la synthèse des protéines FeS, la synthèse de l'hème, le métabolisme des acides gras, le transport du calcium et l'homéostasie, le métabolisme des espèces réactives de l'oxygène, le pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le contrôle du cytochrome c libération et apoptose, et fission et fusion. Les analyses des dysfonctionnements dans ces voies spécifiques nécessiteront des approches spécialisées plutôt que les approches bioénergétiques générales décrites dans le présent document.

Résumé : dosage des dysfonctionnements dans les mitochondries isolées

Le test le plus simple et le plus révélateur du dysfonctionnement énergétique dans les mitochondries isolées consiste à mesurer le contrôle respiratoire mitochondrial. Les valeurs absolues des taux de respiration dans différents états et conditions, et les mesures qualitatives de pmf, peuvent clarifier les mécanismes, mais le meilleur moyen d'obtenir un aperçu mécaniste est de titrer simultanément à la fois le taux de respiration et le pmf et de tracer la cinétique des différents modules de phosphorylation oxydative ( Figure 2B). Les tests candidats des quantités ou des activités de complexes et d'enzymes spécifiques, de la morphologie mitochondriale et des réponses à des facteurs de stress spécifiques peuvent être utiles pour tester des hypothèses spécifiques, mais doivent généralement être réservés et ne pas être utilisés comme test principal pour le dysfonctionnement mitochondrial.


Biologie Mitochondriale

- La charge moyenne des amas de fer est comprise entre Fe2+ et Fe3+.

- Les amas ne peuvent contenir qu'un électron à la fois.

- La force énergétique provenant de l'électron transmis du NADH qui a été transmis aux amas de flavoprotéines et de fer-soufre, est traduite en une force physique qui déplace la structure du tunnel.

- Le CoQ chargé se lie au site d'amarrage du complexe 3. 2 protons libérés de CoQH2 dans l'espace de la membrane mitochondriale interne.

- Un électron d'énergie inférieure (l'un des deux) est transmis à travers un amas de fer-sulfure pour embarquer dans le cytochrome C.

- L'électron de plus haute énergie est transporté à travers le cytochrome B au sein du complexe 3, puis est forcé sur CoQ pour fabriquer CoQH. LA FORME RADICALE DE COQ (CoQH).

- La forme radicalaire étant très instable, elle reçoit un autre électron transmis par le cytochrome B (d'un autre dernier CoQH2 arriviste au complexe 3). Cela remplit le radical qui en fait à nouveau CoQH2. Celui-ci revient vers le site de liaison du complexe 3, puis libère les deux protons associés à la CoQH2 nouvellement formée.


Applications du rayonnement

  • Traitement du cancer : la radiothérapie est utilisée pour détruire les cellules cancéreuses. La radiothérapie traditionnelle utilise des rayons X ou des rayons gamma à haute énergie pour cibler le cancer. En raison de leur longue portée, cela peut endommager les cellules saines environnantes. Pour minimiser ce risque, les traitements sont généralement programmés en plusieurs petites doses. La thérapie par faisceau de protons est une forme de traitement relativement nouvelle. Il utilise des protons de haute énergie (provenant d'un accélérateur de particules) pour cibler les cellules. Le taux de perte d'énergie pour les ions lourds, tels que les protons, suit une courbe de Bragg distinctive, comme indiqué ci-dessous. La courbe montre que les protons ne déposeront de l'énergie que jusqu'à une distance bien définie et, par conséquent, les dommages aux cellules saines sont réduits.

La forme typique d'une courbe de Bragg, montrant la variation du taux de perte d'énergie pour un ion lourd, tel qu'un proton, avec la distance parcourue. La chute brutale (pic de Bragg) est exploitée par la thérapie par faisceau de protons.


6. Conception de blindage

Dans cette section, nous passerons brièvement en revue la conception du blindage pour protéger les humains contre les rayonnements parasites. En particulier, nous nous concentrerons sur les barrières de blindage en vrac (par exemple les murs, les plafonds) et les labyrinthes. Le blindage en vrac est un aspect extrêmement important de la conception des installations, car l'équipement de protonthérapie est capable de produire des niveaux mortels de rayonnement parasite. De plus, le blindage en vrac empiète sur l'espace disponible pour l'équipement et le personnel et il est coûteux. À bien des égards, la conception d'un blindage en vrac est un problème d'ingénierie classique. On développe une solution qui comprend un équilibre acceptable des attributs concurrents de sécurité, d'utilité et de coût.

En gros, pour concevoir un blindage, il faut avoir une connaissance de la production, du transport et de l'atténuation des rayonnements parasites dans les barrières de blindage. De plus, les objectifs de conception du blindage, c'est-à-dire le taux d'exposition admissible à un emplacement occupé, dépendent de la fraction de temps qu'une zone est occupée, de sa désignation comme zone contrôlée ou non contrôlée, et du type d'individus présents, c'est-à-dire les patients, le personnel ( travailleurs sous rayonnement) et le grand public. Il y a généralement plusieurs objectifs de conception à atteindre, par ex. un pour les expositions à court terme (moyenne sur une heure) et un pour les expositions à long terme (moyenne sur un an). En général, on ne sait pas a priori quel objectif de conception régira en fin de compte la conception du blindage, nécessitant des calculs de blindage qui représentent plusieurs scénarios.

Avant d'aborder la physique de base de la conception du blindage, nous faisons une brève digression pour souligner que les barrières de blindage sont l'un des nombreux éléments nécessaires d'un programme de radioprotection efficace. Les barrières de blindage ne garantissent pas à elles seules la sécurité. Il est peu pratique, sans parler d'un coût prohibitif, de construire des boucliers qui par eux-mêmes offrent une protection adéquate pour une utilisation sans restriction des systèmes de protonthérapie contemporains. Des contrôles administratifs sur l'utilisation des faisceaux sont donc nécessaires et, pour des raisons évidentes, l'utilisation prévue des faisceaux doit être prise en compte dans le processus de conception du blindage. La connaissance de l'utilisation des faisceaux de protons est souvent difficile à prévoir, en particulier pour les unités de traitement de premier ordre où la production de neutrons dans les systèmes de production et de livraison de faisceaux est mal connue. En outre, le résultat futur d'un essai clinique ou un changement de politique de soins de santé peut modifier considérablement l'utilisation des faisceaux de protons. Laissant ces incertitudes de côté, il faut connaître non seulement l'utilisation du faisceau (énergies, charges et courants, et directions de déplacement) à chacun des emplacements de traitement, mais aussi tous les taux de perte de protons correspondants dans l'accélérateur, le système de sélection d'énergie ( le cas échéant), système de transport du faisceau et tête de traitement. Les pertes de protons et la production de neutrons varient fortement avec l'énergie du faisceau de protons et d'autres facteurs (voir figure 22), ce qui nécessite des calculs séparés pour plusieurs énergies de faisceau de protons (Newhauser et al 2002d). De nombreux aspects du blindage des installations de protonthérapie sont similaires à ceux des installations de photothérapie, qui ont été examinés en détail ailleurs (NCRP 2008).

Graphique 22. (Supérieur) Niveau de traitement de l'installation de protonthérapie : cyclotron de 235 MeV (1), dégradateur d'énergie en graphite à épaisseur variable (2), aimants d'analyse de la quantité de mouvement (3), fentes (4), collimateur en laiton (5) et arrêt de faisceau à l'isocentre (6). Le plan montre également la salle de contrôle principale (b), la sortie du labyrinthe de la salle de traitement (m, n, o, a) et divers couloirs et salles occupées au niveau supérieur (c-k) (Newhauser et al 2002c). (Inférieur) Spectres d'équivalent de dose de neutrons calculés aux emplacements l–o dans la salle du portique et son labyrinthe (voir figure 1) produits par un faisceau de protons de 235 MeV. L'ordonnée correspond au produit du coefficient de conversion fluence neutronique en équivalent dose h??, la fluence spectrale des neutrons ??E, et l'énergie des neutrons Em, où le produit est normalisé à l'équivalent de dose total de neutrons H. Ces spectres révèlent des différences de forme dues aux contributions relatives des pics dus aux neutrons thermiques, aux neutrons d'évaporation et aux neutrons en cascade. La région entre 10 –6 et 10 –2 MeV, correspondant à 1/Em comportement de la fluence spectrale, contribue relativement peu à l'équivalent de dose total (reproduit avec la permission de Newhauser et al 2002c).

En supposant que l'utilisation du faisceau, les facteurs d'occupation et d'autres aspects soient connus, on peut calculer le débit d'équivalent de dose de neutrons à un point d'intérêt derrière une dalle de blindage (par exemple, mur, plafond, etc.) qui est parallèle et à une distance une le faisceau de protons selon

H(Ep,, d/λ) est l'équivalent de dose ambiant au-delà du bouclier, Ep est l'énergie du faisceau de protons, ?? est l'angle d'émission entre le point de perte de protons et le point d'intérêt, r est la distance entre le point de perte de protons et le point d'intérêt, est l'épaisseur du bouclier, ??(??) est la longueur d'atténuation du matériau de blindage, Ho(Ep, ??) est le terme source, ?? est l'angle d'incidence du rayonnement frappant le blindage, et g(a) est le facteur d'obliquité correspondant. Cette approche semi-empirique, basée sur les travaux de Moyer (1962), présente de nombreux attributs attrayants, notamment l'inclusion de dépendances majeures, la simplicité et la vitesse de calcul. Cinq décennies plus tard, malgré ses limites, le modèle Moyer est toujours largement utilisé, en particulier dans les cas où la vitesse et la commodité sont plus importantes que la précision.

Le personnel doit être en mesure d'entrer et de sortir rapidement des chambres fortes protégées, par ex. pour un fonctionnement clinique de routine efficace, en cas d'urgence, par exemple pour soigner un patient malade, et pour entretenir et réparer l'accélérateur et le système de transport du faisceau. Cela nécessite de grandes ouvertures dans les parois de blindage en vrac. Il est évident que de telles ouvertures entraînent une diminution de l'atténuation qui doit être restaurée. Typiquement, l'atténuation requise est restaurée en équipant l'ouverture d'un tunnel de protection long et incurvé, communément appelé labyrinthe ou labyrinthe. Le labyrinthe atténue le rayonnement incident de deux manières : ses parois atténuent le rayonnement pénétrant profondément qui est incident sur les parois du labyrinthe, et il atténue le rayonnement moins pénétrant qui pénètre dans l'ouverture du labyrinthe par une combinaison de diffusion et d'absorption processus à mesure que le rayonnement se propage à travers le labyrinthe.

Typiquement, les dédales des salles de soins ne sont pas équipés de portes blindées massives car elles peuvent augmenter considérablement les temps d'accès. D'autre part, les chambres fortes peu fréquentées (par exemple pour l'accélérateur et le système de transport de faisceaux) utilisent généralement un labyrinthe équipé d'une porte blindée massive.

Le débit d'équivalent de dose à l'extérieur du labyrinthe (sans porte) du rayonnement diffusé qui pénètre à l'entrée du labyrinthe (à l'intérieur de la voûte) est donné par

r1 est la distance de ligne de vue entre la source et le point d'intérêt dans la première branche (la plus proche de la source) du labyrinthe, Ho(a) est l'équivalent de dose à distance une de la source, une est la distance de la source à l'entrée de la première branche, et Fje(rje) sont des facteurs d'atténuation pour les segments suivants du labyrinthe (Agosteo 2009). Ceux-ci sont donnés par

rje est la distance de l'entrée du jeétape jusqu'au point d'intérêt dans cette étape, et où UNEje est l'aire de la section transversale du jeétape du labyrinthe (Agosteo 2009). De plus, il faut toujours (séparément) considérer l'atténuation du rayonnement frappant l'extérieur des parois du labyrinthe (par exemple en utilisant le modèle Moyer) et l'atténuation dans les portes du labyrinthe, dans les cas où elles sont utilisées. L'atténuation du labyrinthe augmente avec le nombre et la longueur des jambes, l'épaisseur des parois du labyrinthe et diminue avec la section transversale. Il serait difficile d'exagérer l'importance relative élevée de la conception des labyrinthes. Heureusement, il existe plusieurs méthodes de conception bien comprises, précises et validées par des mesures dans des installations cliniques de protonthérapie.

Les matériaux utilisés pour les barrières de blindage en vrac et les labyrinthes varient quelque peu, en fonction du coût et de la disponibilité des matériaux de blindage et du coût de l'espace occupé par les barrières de blindage. En règle générale, le béton ordinaire avec armature en acier est utilisé en raison de sa forte teneur en hydrogène et de sa densité massique (2,35 g cm -3 ), de sa résistance élevée, de sa bonne disponibilité et de son faible coût. Les centres de protonthérapie contemporains utilisent des barrières de blindage en béton pouvant atteindre plusieurs mètres d'épaisseur (Newhauser et al 2002, Titt et Newhauser 2005). La longueur d'atténuation des neutrons, ou l'épaisseur nécessaire pour réduire la fluence incidente d'un facteur 1/e, est tracée à la figure 23 pour le béton ordinaire. A la limite de haute énergie, la longueur d'atténuation est d'environ 50 cm de béton ordinaire (Moritz 2001).La densité et les propriétés d'atténuation du béton peuvent être considérablement augmentées en utilisant un matériau d'agrégat à haute densité, mais son coût plus élevé est prohibitif dans la plupart des cas. Certaines installations ont utilisé des boucliers « locaux » relativement petits, par ex. pour protéger les composants de la ligne de lumière qui produisent de grandes quantités de neutrons, pour réduire les exigences d'atténuation des plus gros boucliers en vrac. Dans certains cas, des matériaux de densité plus élevée tels que des alliages de fer (7,9 g cm -3 ) ou de tungstène (19,25 g cm -3 ) peuvent être avantageux pour le blindage contre les neutrons de haute énergie car ils peuvent être rendus plus compacts qu'avec du béton ou d'autres matériaux de blindage en vrac. Les bouchons de faisceau de protons, qui empêchent le faisceau de protons primaire d'impacter le blindage en vrac, ont été fabriqués à partir de divers matériaux, notamment le plastique et l'acier.

Figure 23. La longueur d'atténuation des neutrons dans le béton contre énergie du faisceau de protons (reproduit avec la permission d'Agosteo et al 2007).

Les méthodes de conception de blindage les plus souvent utilisées pour les installations de protonthérapie sont les formules analytiques et les simulations de Monte Carlo. La connaissance des incertitudes dans les prédictions de ces deux méthodes est incomplète. Newhauser et al (2002c) ont mesuré, calculé (à l'aide de modèles analytiques semi-empiriques qui ont été développés pour la géométrie de blindage des dalles et des labyrinthes) et simulé les débits de dose de neutrons dans un centre de protonthérapie de 235 MeV, et ils ont découvert que le modèle analytique surestimait la dose de neutrons dans la plupart des positions. par rapport aux mesures, tandis que les simulations de Monte Carlo concordaient plus étroitement avec les mesures. Cependant, la méthode de Monte Carlo est considérablement plus difficile en raison de la nécessité d'obtenir une convergence des solutions généralisées et des techniques automatisées de réduction de la variance font défaut. Titt et Newhauser (2005) ont évalué l'incertitude associée à la technique de blindage Monte Carlo en comparant les prévisions analytiques avec des simulations Monte Carlo détaillées de doses équivalentes de neutrons à divers emplacements de récepteurs. Ils ont trouvé que le critère de rejet optimal était une incertitude statistique de 10 % pour les simulations de Monte Carlo. Ce critère de rejet a fourni une confiance supplémentaire car pratiquement tous les résultats simulés acceptés avaient convergé.

Dans une étude non publiée, l'un d'entre nous (WN) a estimé le coût du béton et de l'acier utilisés pour le blindage d'une protonthérapie multi-pièces typique à environ 6 M USD, avec le potentiel de réduire les coûts de blindage de près d'un tiers grâce à des conceptions améliorées de blindage neutronique. . De toute évidence, il existe un potentiel considérable pour réaliser des économies de coûts et d'autres avantages en développant des méthodes de conception de blindage améliorées et en optimisant les conceptions de blindage.

Bien que nous n'ayons pas discuté des petits boucliers locaux des composants de la ligne de lumière dans cette section, il y a un chevauchement considérable avec le matériel présenté dans la section précédente, par souci de concision, nous ne considérerons pas ici le rayonnement parasite à l'intérieur d'une salle de traitement.


Le rôle de la protéine de découplage 3 en physiologie humaine

Division d'endocrinologie, diabète et génétique médicale et Département de médecine, Université médicale de Caroline du Sud, et Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center, Charleston, Caroline du Sud, États-Unis

Adressez la correspondance à : W. Timothy Garvey, Division of Endocrinology, Diabetes, and Medical Genetics, Clinical Science Building 816, Medical University of South Carolina, 96 Jonathan Lucas Street, Charleston, South Carolina 29425, États-Unis. Téléphone : (843) 876-5372 Télécopieur : (843) 876-5133 Courriel : [email protected]

Publié le 15 février 2003 - Plus d'infos

L'obésité est simplement comprise comme un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques en faveur de l'accumulation de poids. Cependant, l'interface biologique humaine entre la consommation alimentaire et la dissipation d'énergie entraîne de grandes différences individuelles dans le comportement alimentaire, l'activité physique et l'efficacité du stockage et du métabolisme du carburant. En particulier, le taux métabolique basal, qui représente la plus grande partie de la dépense énergétique globale, peut varier presque du simple au double selon les individus. Classiquement, on pense que trois systèmes biochimiques majeurs contribuent à la thermogenèse basale : les cycles futiles, l'activité Na + /K + ATPase et la fuite de protons mitochondriaux. Ce dernier est le contributeur quantitatif le plus important et peut expliquer jusqu'à 50 % du métabolisme de base (1). La base moléculaire de la fuite de protons mitochondriaux n'est pas claire, malgré son importance dans la compréhension de l'équilibre énergétique et son potentiel en tant que cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. L'article de Hesselink et de ses collègues dans ce numéro du JCI (2) examine si le découplage de la protéine 3 contribue à la fuite de protons mitochondriaux dans le muscle squelettique humain.

L'oxydation des acides gras et du pyruvate a lieu dans les mitochondries, où l'énergie est convertie en ATP pour être utilisée dans les processus cellulaires. Les équivalents réducteurs sont extraits des substrats et transmis séquentiellement des donneurs d'électrons (réducteurs) aux accepteurs (oxydants) le long de la chaîne respiratoire mitochondriale jusqu'à l'oxygène moléculaire. Le système de transport d'électrons est situé sur la membrane mitochondriale interne, où les étapes d'oxydation sont couplées par la chaîne de transport à l'extrusion de protons hors de la matrice. Cela établit une différence de potentiel électrochimique à travers la membrane interne et une force motrice pour la rentrée des protons à travers F1F0-ATP synthase. L'ATP synthase capture l'énergie potentielle libérée lors de la rentrée des protons en convertissant l'ADP en ATP. De cette manière, le transport des électrons est couplé à la phosphorylation oxydative. Dans un système parfaitement couplé, les protons ne pénètrent dans la matrice mitochondriale que par l'ATP synthase en présence d'ADP. Cette forme de respiration est classée dans l'état 3 (c'est-à-dire O2 n'est consommé qu'en présence de substrat et d'ADP). Cependant, on peut également observer que les mitochondries utilisent de l'oxygène même en l'absence d'ADP, ce qui se produit lorsque des protons retournent dans la matrice via un mécanisme qui n'implique pas F1F0-ATPase. Cette fuite de protons réduit le gradient de protons entraînant la formation d'ATP et découple la respiration de la phosphorylation oxydative. L'utilisation de l'oxygène en l'absence d'ADP ou dans des mitochondries totalement découplées est appelée respiration de l'état 4.

Les mécanismes de médiation de la fuite de protons indépendante de l'ATPase n'ont pas été identifiés, sauf dans le tissu adipeux brun (BAT) des mammifères. Le BAT est riche en mitochondries et en gouttelettes lipidiques et est une source majeure de thermogenèse sans frisson, utilisée par la plupart des mammifères pour résister au froid. Cette fonction est médiée par la protéine de découplage 1 (UCP1) (anciennement connue sous le nom de protéine de découplage ou thermogénine), clonée pour la première fois en 1985 (3). UCP1 se localise dans la membrane interne mitochondriale et dissipe le potentiel transmembranaire en transportant des protons de l'espace intermembranaire vers la matrice. Cela réduit la force motrice des protons qui entraîne la formation d'ATP, et la respiration dans les mitochondries non couplées se poursuit, libérant de l'énergie combustible uniquement sous forme de chaleur. Chez l'homme et d'autres grands mammifères, le BAT disparaît après la petite enfance, et l'expression d'UCP1 est minime ou inexistante chez l'adulte. Cependant, même en l'absence d'UCP1, il existe une fuite de protons finie à travers la membrane interne qui ne peut pas être expliquée par une simple diffusion (4). Cela a conduit les chercheurs à rechercher des protéines de découplage supplémentaires avec une expression tissulaire plus large, et deux autres membres de la famille des protéines de découplage ont été identifiés en 1997. Les gènes codant pour l'UCP2 humaine (5, 6) et UCP3 (7, 8) se trouvent à proximité de sur le chromosome 11q13 et partagent respectivement 55 % et 57 % d'identité d'acides aminés avec UCP1. L'ARNm d'UCP2 est largement exprimé dans plusieurs tissus, tandis qu'UCP3 présente une expression tissu-spécifique plus limitée confinée au muscle squelettique et au tissu adipeux brun. Les UCP ont une topologie prédite similaire consistant en six régions transmembranaires liées par des boucles polaires et sont localisées dans la membrane mitochondriale interne. Plus récemment, deux autres gènes de type UCP, UCP4 et UCP5/brain mitochondrial carrier protein-1, ont été identifiés, qui sont exprimés dans le cerveau et ont une identité d'acides aminés relativement plus faible avec UCP1 (30-40%).

En raison de leur homologie avec UCP1 et de leur expression dans les tissus adultes, UCP2 et UCP3 ont immédiatement été considérés comme des candidats attractifs pour les protéines impliquées dans la dépense énergétique. Lorsqu'ils sont exprimés dans des lignées cellulaires de levure et de mammifères, UCP2 et UCP3, comme UCP1, se sont avérés agir comme des découpleurs, comme en témoignent une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale et une augmentation de l'état mitochondrial 4 respiration, cellule entière O2 consommation et production de chaleur. De plus, UCP1, UCP2 et UPC3 partageaient la capacité d'être régulés par des facteurs importants dans l'équilibre énergétique, notamment les agonistes des récepteurs β3-adrénergiques, la triiodothyronine, la prise alimentaire et l'exposition au froid (bien que le froid ait exercé des effets plus modestes sur UCP2 et UCP3 que sur UCP1). Cependant, le paradigme a commencé à s'effilocher lorsque les résultats de l'expérimentation animale entière ont été considérés. Premièrement, le jeûne et l'alimentation riche en graisses chez les rongeurs se sont avérés réguler à la hausse UCP2 et UCP3, même si le premier a entraîné une diminution de la dépense énergétique et le dernier a eu l'effet inverse (3). Deuxièmement, les souris knock-out UCP2 et UCP3 présentaient un poids corporel normal lorsqu'elles consommaient de la nourriture conventionnelle ou riche en graisses, ainsi qu'une température corporelle normale à température ambiante et en réponse au froid (9, 10). Paradoxalement, les mitochondries isolées du muscle squelettique de souris nulles UCP3 présentaient une fuite de protons réduite, une augmentation du rapport ATP/ADP et une diminution de la respiration à l'état 4, ce qui correspond à un effet de découplage pour UCP3 lorsqu'il est présent dans la nature. -type souris. Les souris transgéniques hyperexprimant UCP3 ont été caractérisées par une réduction du poids corporel, malgré leur hyperphagie, par une augmentation de l'O au repos2 consommation, et par une augmentation de la température musculaire mais pas de la température centrale. Dans le même temps, les mitochondries isolées présentaient une diminution du potentiel transmembranaire et une augmentation de la respiration à l'état 4. Ces résultats chez les souris transgéniques étaient plus cohérents avec un rôle de l'UCP3 en tant que découpleur mitochondrial.

Hesselink et al. (2) ont étudié la capacité d'UCP3 à agir comme découpleur dans le muscle squelettique humain suite à une augmentation de l'expression d'UCP3 induite par le régime. Des volontaires masculins en bonne santé ont exprimé 44% plus de protéines UCP3 dans le muscle squelettique tout en consommant un régime riche en graisses qu'en consommant un régime pauvre en graisses. Les chercheurs ont évalué la fonction mitochondriale in vivo en mesurant la resynthèse de la phosphocréatine à la suite de contractions musculaires anoxiques. Pour permettre des poussées rapides de contraction musculaire, des liaisons phosphate à haute énergie sont stockées sous forme de phosphocréatine, qui est formée par transfert de phosphate de l'ATP à la créatine catalysé par la créatine kinase. Le taux de resynthèse de la phosphocréatine reflète les taux de synthèse de l'ATP via la mitochondrie F1F0-ATPase, qui à son tour est affectée par l'étendue du découplage mitochondrial. Les auteurs ont observé des évolutions temporelles similaires de la réplétion de la phosphocréatine dans les sous-groupes nourris à haute teneur en graisses et à faible teneur en graisses, indiquant que la régulation à la hausse physiologique d'UCP3 avec une alimentation riche en graisses n'affectait pas la fuite de protons mitochondriaux in vivo. Les auteurs ont également constaté que les quantités relatives de carnitine et d'acylcarnitine libres étaient similaires dans les deux sous-groupes, vérifiant qu'il n'y avait pas de différences dans la disponibilité du substrat (au moins à partir des acides gras à longue chaîne). Les auteurs ont pu rejeter leur hypothèse initiale et conclure que l'UCP 3 n'agit pas comme un découpleur mitochondrial dans le muscle humain dans ces conditions physiologiques.

L'article est instructif pour plusieurs raisons. Premièrement, les auteurs ont quantifié l'expression d'UCP3 au niveau de la protéine en utilisant des anticorps purifiés par affinité bien caractérisés et spécifiques. La littérature à ce jour s'est fortement appuyée sur des mesures d'ARNm pour étudier l'expression d'UCP2 et d'UCP3, car les anticorps disponibles manquaient de spécificité. Deuxièmement, les auteurs ont évalué le découplage mitochondrial in vivo à la suite d'une perturbation physiologique des niveaux d'UCP3 induite par l'alimentation. Chez les souris knock-out, la preuve que UCP2 ou UCP3 fonctionne comme un découpleur provient d'expériences réalisées dans des mitochondries isolées ex vivo, et non dans des tissus intacts. L'absence d'effets sur le métabolisme énergétique et le poids corporel chez ces souris suggère que le découplage dans les mitochondries isolées ne se produit pas in vivo ou n'est pas physiologiquement significatif. De plus, Brand et ses collègues ont récemment découvert que le découplage en présence d'hyperexpression supraphysiologique d'UCP3, aux niveaux élevés obtenus chez la levure transfectée et chez les souris transgéniques UCP3, était induit par un artefact et ne représentait pas les propriétés de la protéine native (11). . Cette observation rend difficile l'obtention d'informations physiologiques significatives à partir de l'étude des souris transgéniques (12), qui hyperexprimaient UCP3 plus de 50 fois au-dessus du niveau des souris de type sauvage (11). L'image émergente est que des informations physiologiques précises peuvent être obtenues en toute confiance lorsque le découplage mitochondrial est évalué in vivo dans la plage physiologique de la régulation UCP.

Troisièmement, les auteurs ont étudié les êtres humains. Alors que les expériences sur des souris transgéniques ont été très prisées par les revues biomédicales de première ligne, les expériences impliquant la physiologie humaine ont été relativement sous-évaluées à mon avis. En particulier dans le domaine de la dépense énergétique, il est problématique d'extrapoler les données des souris transgéniques à la physiologie humaine car les humains adultes n'ont pas de graisse brune et la production de chaleur par kg de poids corporel est beaucoup plus faible chez les humains que chez les rongeurs. Cette leçon a été apprise dans le cas de la leptine, qui exerce des effets majeurs sur la température corporelle chez les rongeurs, alors que cette action physiologique est nettement atténuée ou absente chez l'homme (13, 14). Les observations de Hesselink et al. ( 2 ) ne sont pas seulement directement pertinents pour la physiologie humaine, mais constituent certaines des données les plus solides de tout système traitant du rôle biochimique de base de l'UCP3 en tant que découpleur. Dans l'ensemble, l'article semble prouver le vieil adage selon lequel, si vous voulez comprendre la physiologie humaine, vous devez parfois simplement étudier les humains.

Il existe également des limites à l'interprétation des données. Les auteurs ne peuvent exclure la possibilité que les perturbations alimentaires aient induit un autre facteur qui module un effet de découplage de l'UCP3 ou qu'un effet de découplage ait été trop faible pour être discerné en utilisant cette méthodologie, malgré les preuves rassemblées par les auteurs que le taux de réplétion de la phosphocréatine est sensible au substrat mitochondrial. disponibilité. Les auteurs soulignent également que la régulation à la hausse de l'UCP3 aurait pu être contrebalancée par la régulation à la baisse de l'UCP2 (ou celle d'autres découpleurs non identifiés), ce qui n'aurait entraîné aucun changement net dans la fuite de protons mitochondriaux. Les auteurs écartent cette possibilité pour deux raisons, les niveaux d'ARNm d'UCP2 sont restés inchangés, et d'autres auteurs ont fourni des preuves immunologiques que la protéine UCP2 n'est pas exprimée dans le muscle malgré la présence d'ARNm d'UCP2 (15). Même ainsi, ces dernières observations ont été rapportées dans le muscle de rongeur, laissant ouverte la possibilité que la protéine UCP2 soit présente dans le muscle humain.

Si les conclusions des auteurs sont correctes, quel est alors le rôle biochimique de l'UCP3 chez l'homme ? Cette question reste une question intrigante et importante pour les recherches futures. Plusieurs chercheurs soutiennent l'idée que UCP2 et UCP3 jouent un rôle dans la réduction de la formation d'espèces réactives de l'oxygène et protègent ainsi les cellules de leurs effets néfastes (16). Les espèces réactives de l'oxygène sont produites au cours de la respiration mitochondriale d'une manière proportionnelle au potentiel transmembranaire. Par conséquent, ce rôle nécessiterait que UCP3 fonctionne comme un découpleur. Une autre hypothèse intéressante est que UCP3 pourrait faciliter l'oxydation des lipides en agissant comme un transporteur d'anions FFA. Des taux de FFA circulants élevés sont associés à une expression accrue d'UCP3 musculaire dans divers états physiologiques (jeûne, alimentation riche en graisses, perfusion de lipides, diabète, obésité) indépendamment de tout changement dans la dépense énergétique (3, 17, 18). De plus, nous avons décrit un polymorphisme donneur/accepteur d'épissage de l'exon 6 dans UCP3 qui est associé à une réduction marquée des taux d'oxydation des lipides basaux et à une augmentation du quotient respiratoire au repos chez les Afro-Américains parlant le Gullah (19). Il est difficile d'expliquer comment un transporteur d'anions FFA pourrait faciliter l'oxydation des FFA puisque l'entrée des FFA à longue chaîne par la carnitine palmitoyltransférase I et l'oxydation ultérieure nécessitent une estérification en CoA. Cependant, dans des conditions de flux élevé d'acyl-CoA et d'oxydation des lipides, l'accumulation d'acyl-CoA serait préjudiciable à la fonction mitochondriale car ces molécules sont des tensioactifs puissants qui pourraient endommager les membranes et une séquestration excessive de CoA sous forme d'esters FFA à longue chaîne pourrait inhiber -oxydation et activité du cycle de l'acide tricarboxylique. Les UCP sont connus pour être capables d'exporter l'anion FFA de la matrice mitochondriale (20), mais cela ne pourrait aider à atténuer l'accumulation d'acyl-CoA que si une thioestérase était disponible pour éliminer le CoA de la FFA. Récemment, Moore et al. ont montré que la thioestérase-1 mitochondriale est régulée à la hausse chez les souris hyperexprimant UCP3 et ont proposé que cette enzyme puisse remplir cette fonction même dans des contextes d'augmentation du flux d'acyl-CoA (21). Ainsi, il est possible de suggérer que UCP3 pourrait aider à maintenir des taux accrus d'oxydation des lipides via l'exportation de l'anion FFA. Dans tous les cas, alors que la recherche du véritable rôle physiologique de l'UCP3 se poursuit, des conclusions sûres concernant la physiologie humaine nécessiteront des études chez l'homme.

Voir l'article connexe commençant à la page 479.

Conflit d'intérêt: L'auteur a déclaré qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts.

Abréviations non standard utilisées : tissu adipeux brun (BAT) découplant la protéine 1 (UCP1).


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