Informations

Bactéries sans plasmide

Bactéries sans plasmide


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Je travaille actuellement sur la résistance aux antibiotiques et je serais très intéressé de savoir quelle bactérie n'a pas de plasmide, de la même manière que M. tuberculose. Cela m'aiderait beaucoup pour mon travail et je n'ai pas réussi à obtenir autant d'informations en ligne.

Merci beaucoup pour votre réponse !


Vous voudrez peut-être jeter un œil à Bacillus subtilis. La plupart des souches de laboratoire ne contiennent pas de plasmides, bien qu'ils aient été trouvés dans certains isolats environnementaux.

https://academic.oup.com/femsre/article/21/4/337/490925

Tout cela dépend exactement de ce que vous recherchez : une espèce sans plasmides connus dans aucun isolat, ou des souches de laboratoire couramment utilisées sans plasmides ?

M. tb est un cas assez unique. La plupart des autres espèces du Mycobactérie genre contient des plasmides.


Transformation bactérienne

Biotechnologie fait référence à la technologie utilisée pour manipuler l'ADN. Les procédures sont souvent appelées ingénierie génétique.

L'ADN est le matériel génétique de tous les organismes vivants et tous les organismes utilisent le même code génétique. Les gènes d'un type d'organisme peuvent être transcrits et traduits lorsqu'ils sont placés dans un autre type d'organisme.

Par exemple, des gènes humains et autres sont couramment introduits dans des bactéries afin de synthétiser des produits destinés à un traitement médical et à un usage commercial. L'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine et les vaccins sont produits par des bactéries.

ADN recombinant fait référence à l'ADN de deux sources différentes. Les individus qui reçoivent des gènes d'autres espèces sont transgénique.

Vecteurs

Les vecteurs sont de l'ADN utilisé pour transférer des gènes dans une cellule hôte.

Plasmides peuvent être utilisés comme vecteurs pour transformer les bactéries. La bactérie hôte absorbe le plasmide, qui comprend le gène étranger.

Les gènes marqueurs peuvent être utilisés pour déterminer si le gène a été repris. Les gènes marqueurs doivent avoir une caractéristique distincte. Par exemple, si vous placez un gène qui permet une résistance à l'ampicilline sur le même vecteur que le même vecteur que le gène de la protéine fluorescente verte, alors toutes les bactéries qui se développent sur une plaque d'ampicilline auront également le gène de la protéine fluorescente verte. Les bactéries qui n'ont pas le gène ne survivront pas sur ces plaques.

Le plasmide pGLO

Le plasmide utilisé dans cet exercice a été modifié en supprimant les gènes de structure de l'opéron arabinose (ara A, ara B et ara D). Ces gènes ont été remplacés par un gène d'une méduse bioluminescente qui code pour la production de protéine fluorescente verte (GFP). Cette protéine brille lorsqu'elle est éclairée par la lumière UV. Parce que ce gène est adjacent au promoteur de l'arabinose, il devient actif en présence d'arabinose. Le plasmide modifié est appelé pGLO.

Le plasmide pGLO contient également un gène qui permet à la bactérie d'être résistante à l'antibiotique ampicilline. Les bactéries qui ont absorbé ce plasmide sont capables de se développer sur des milieux contenant de l'ampicilline.

Les matériaux nécessaires

Le matériel suivant sera nécessaire pour chaque groupe :

4 microtubules (ignorer les couleurs des tubules) :

1 microtubule contenant la solution de transformation

1 microtubule contenant du bouillon LB

1 microtube vide marqué + (ou + ADN)

1 microtube vide étiqueté - (ou - ADN)

1 récipient avec de l'eau glacée

1 paquet de. boucles d'inoculation

1 micropipette capable de mesurer 250 ul et embouts de micropipette

1 micropipette capable de mesurer 100 ul et embouts de micropipette

Procédure

Ajouter une solution de transformation (CaCl2)

Le support de microtube en mousse contient un microtube avec une solution de transformation étiquetée T.S. Ce tube est montré dans le schéma ci-dessus. Utilisez une micropipette pour transférer 250 ul de solution de transformation du tube TS dans votre support en mousse vers le tube étiqueté +DNA et 250 ul supplémentaires dans le tube étiqueté -DNA.

Replacez les tubes dans le support de microtube en mousse, puis faites flotter les quatre tubes dans un récipient d'eau glacée pendant 2 minutes.

Ajouter des bactéries

Utilisez une boucle stérile pour ramasser plusieurs colonies de bactéries de la plaque de démarrage. Cela peut être fait en faisant glisser la boucle sur la plaque afin qu'elle racle légèrement les colonies de la surface. Transférez les bactéries dans le tube ADN + en faisant tourner la boucle rapidement après l'avoir immergée dans le liquide.

Répétez cette procédure en transférant plusieurs colonies de bactéries dans le tube à ADN.

Ajouter de l'ADN

Votre instructeur vous fournira une bouteille contenant de l'ADN plasmidique. Immerger une boucle stérile dans la bouteille contenant l'ADN plasmidique. Lorsque le centre de l'anse est recouvert d'un film de type savon, transférez-y le microtube + ADN (voir photo ci-dessous). Utilisez une nouvelle boucle stérile pour transférer une deuxième boucle d'ADN plasmidique dans le même microtube (+ ADN). Le - microtube à ADN ne recevra aucun ADN plasmidique.

Faire flotter les deux tubes dans leur support en mousse dans de l'eau glacée pendant 10 minutes.

Sommaire

Le tube + ADN contient des bactéries et de l'ADN d'une autre source. Le tube à ADN ne contient que des bactéries.

En attendant.

En attendant que les tubes refroidissent, utilisez un marqueur pour étiqueter vos plaques de gélose avec une lettre qui indique le type de bactéries qu'elles recevront.

Plaque Étiqueter commentaires
LB/ampère + cette plaque recevra des bactéries transformées
LB/amp/ara + cette plaque recevra des bactéries transformées
LB/ampère - cette plaque recevra des bactéries normales non transformées
KG - cette plaque recevra des bactéries normales non transformées

Choc thermique

Le choc thermique est utilisé pour rendre le E. coli cellules plus perméables de sorte qu'elles absorbent plus facilement les plasmides modifiés.

Apportez votre récipient d'eau glacée et les microtubes au bain-marie à 42 degrés.

Transférer le support de microtube en mousse contenant les tubes + et - dans un bain-marie à 42 degrés C pendant exactement 50 secondes, puis remettre les tubes dans de la glace et de l'eau. Il est important que ce choc thermique dure exactement 50 secondes. Afin de s'assurer que l'heure est exacte, demandez à une personne de chronométrer la procédure tandis qu'une autre transfère les tubes dans le bain-marie et les remet au bout de 50 secondes.

Laisser les tubes rester dans l'eau glacée pendant 2 minutes.

Retirez le support de microtubes en mousse contenant les microtubes de l'eau glacée et placez-le sur votre paillasse. Ajouter 250 ul de bouillon LB à chacune des cultures bactériennes (le tube + et le tube -) avec une micropipette.

Laisser les tubes reposer à température ambiante pendant 10 minutes.

Transférer les bactéries dans les plaques de culture

Mélangez le contenu de chacun des tubes en les tapotant avec l'ongle de votre index.

Transférer 100 ul de la solution du + microtubule à la surface de la gélose d'une des plaques marquées + à l'aide d'une micropipette. Transférer 100 ul dans l'autre plaque étiquetée +. Lorsque vous avez terminé, chacune des plaques étiquetées + contiendra 100 ul de bactéries du tube +.

Utiliser un embout de pipette différent pour transférer 100 ul de solution du - microtubule à la surface de la gélose dans l'une des plaques étiquetées -. Transférer 100 ul dans l'autre plaque étiquetée -.

Étaler le mélange sur toute la surface de la gélose dans l'une des plaques à l'aide d'une anse stérile. Utiliser différentes boucles stériles pour étaler les mélanges dans les autres plaques. Le schéma ci-dessous montre la technique stérile.

Incuber les plaques

Retournez les plaques de manière à ce que la gélose soit vers le haut et que le couvercle soit sur la face inférieure. Empilez-les les uns sur les autres puis collez-les ensemble. Écrivez votre nom sur la bande.

Votre instructeur transférera vos plaques dans l'incubateur à 37 degrés du laboratoire de microbiologie. Ils resteront dans l'incubateur pendant 24 à 48 heures.

Élimination et nettoyage

Les boucles usagées, les pipettes usagées, le support de mousse et les microtubules doivent être jetés dans un conteneur à risque biologique. La plaque de gélose contenant les bactéries que vous avez utilisées pour votre culture initiale doit également être jetée dans un conteneur à risque biologique.

La surface de votre zone de travail doit être aspergée de désinfectant et essuyée avec du papier absorbant.

N'oubliez pas de vous laver les mains avant de quitter le laboratoire.

Jour 2 - Collecte et résumé des données

Notez vos résultats dans votre cahier.

Pour chaque assiette, expliquez pourquoi il devrait y avoir de la croissance ou pas de croissance et pourquoi elle devrait briller ou ne pas briller. Un tableau comme celui ci-dessous doit être inclus dans votre cahier.


Utiliser des bactéries

Une méthode courante en génie génétique consiste à trouver un gène pour un produit utile (par exemple, l'insuline) et à obtenir un micro-organisme pour le produire. Cela se fait à l'aide d'un vecteur qui transporte des choses entre les espèces. Lors de l'utilisation de bactéries, le vecteur est le plasmide qui est un cercle d'ADN trouvé dans le cytoplasme bactérien. Il peut être ouvert facilement pour permettre à un fragment d'ADN d'y être inséré. Le vecteur peut être encouragé à entrer dans la cellule en choc thermique, où la température est élevée rapidement de 0 à 40°C. Alternativement, vous pouvez également utiliser électroporation, où une haute tension est utilisée pour perturber la membrane cellulaire.


Les étapes ci-dessus montrent comment le gène est ajouté à un plasmide. Le plasmide possède déjà un gène pour résistance aux antibiotiques à la tétracycline et à l'ampicilline - comme indiqué par les zones noires. Ensuite, une endonucléase de restriction est introduite qui coupera le gène entre le gène de résistance à la tétracycline. Ici, un gène de l'insuline est ajouté. Au bas du diagramme montre les résultats possibles de cette situation.

Il y a une autre situation de plasmide, qui est la même que B, cependant au lieu d'un gène d'insuline perturbant le gène de résistance Tetra, c'est un autre fragment de gène (qui ne nous intéresse pas). Pour simplifier l'explication, cela a été omis.

A l'étape 3, les différentes bactéries avec ces plasmides sont cultivées. En utilisant un processus appelé placage de réplique où un morceau de velours est placé sur les bactéries de la plaque maîtresse, puis transféré pour faire une copie sur la suivante. Les cultures sont ensuite cultivées sur une plaque contenant de l'ampicilline, cela tuera les bactéries sans résistance au gène, c'est-à-dire les bactéries avec plasmide C (anneau sur l'insuline) et des bactéries sans notre plasmide du tout. Ce qui restera sur la plaque Amp sera des bactéries avec les plasmides A et B (voir schéma au dessus de celui-ci). Ceux-ci sont maintenant transférés sur une plaque finale contenant Tétracycline. Cela tuera les bactéries contenant le plasmide B car le Tetra. gène de résistance a été perturbé par le gène de l'insuline. Il ne nous reste plus qu'à comparer les colonies bactériennes pour voir où se trouvent les bactéries contenant de l'insuline.


Sinon, comment les antibiotiques peuvent-ils être utilisés en laboratoire ?

Historiquement, les antibiotiques ont également été utilisés pour perturber les gènes au niveau chromosomique. Les scientifiques introduisent une cassette de résistance aux antibiotiques dans la région codante du gène qu'ils tentent de perturber ou de supprimer, qui à la fois inactive le gène et agit comme un marqueur de la mutation. Lors de la conception de ces types d'expériences, il est recommandé de ne pas utiliser la même cassette de résistance pour la mutation et pour la sélection de plasmide. De plus, les scientifiques peuvent utiliser la perte de résistance comme marqueur d'un clonage réussi. Dans ces cas, le vecteur de clonage a généralement deux cassettes de résistance distinctes et votre gène d'intérêt est cloné dans/inactive ou supprime complètement (dans le cas du clonage Gateway) une cassette. La contre-sélection permet au scientifique de sélectionner des bactéries qui ne sont résistantes qu'à l'antibiotique qui reste intact.


Absorption de plasmides par les bactéries : une comparaison des méthodes et des efficacités

La capacité d'introduire des molécules individuelles d'ADN plasmidique dans des cellules par transformation a été d'une importance capitale pour les récents progrès rapides de la biologie des plasmides et pour le développement de méthodes de clonage d'ADN. La manipulation génétique moléculaire des bactéries nécessite le développement de systèmes de transformation à médiation plasmidique qui incluent (1) la transformation chimique, (2) l'électro-transformation, (3) la transformation biolistique et (4) la transformation sonique, conduisant à l'introduction d'ADN plasmidique exogène. en cellules bactériennes. Dans cette revue, les propriétés de manipulation et l'efficacité de transformation de ces techniques sont décrites. En plus de ces méthodes, une nouvelle technique de transformation conceptuelle, à savoir la méthode d'exposition à l'hydrogel, a été développée. La méthode d'exposition à l'hydrogel, basée sur l'effet Yoshida, constitue une avancée significative par rapport aux moyens chimiques pour transformer de nombreuses souches de Escherichia coli et une variété d'autres espèces bactériennes. Le nouveau terme « transformation des tribus » a été proposé pour cette nouvelle technique. Nous avons également déterminé que, par rapport aux méthodes conventionnelles, la méthode d'exposition à l'hydrogel est une méthode nouvelle et pratique pour transformer les bactéries.

Ceci est un aperçu du contenu de l'abonnement, accessible via votre institution.


RÉSULTATS

Sélection spécifique des doubles croisements en commutant l'état de bûcher

Clostridium acetobutylicum est un organisme industriel qui produit naturellement l'excellent biocarburant butanol, mais le rendement, la spécificité et l'utilisation des matières premières du processus de fermentation pourraient chacun être améliorés par l'ajout d'ADN codant pour des enzymes hétérologues (10). Cela nous a motivé à développer une méthode d'intégration d'ADN robuste pour C. acetobutylicum . Notre première approche nécessite un gène qui est à la fois sélectionnable positivement et négativement, tel que bûcher ou pyrF , qui codent respectivement pour les enzymes de biosynthèse de la pyrimidine, l'orotate phosphoribosyltransférase et l'orotidine 5-phosphate décarboxylase. Les cellules qui contiennent bûcher et pyrF peuvent être sélectionnés sur un milieu de croissance dépourvu d'uracile, car ils sont nécessaires à la biosynthèse de l'uracile. Inversement, les cellules dépourvues de bûcher ou pyrF peut être sélectionné sur milieu de croissance supplémenté en FOA, car ce composé n'est hautement toxique que pour les cellules qui contiennent cette voie. FOA a été utilisé pour la contre-sélection depuis un certain temps (11) et dans divers organismes (12-17), y compris très récemment dans Clostridium thermocellum ( 18 ).

Isoler les clones à double croisement en exploitant un changement d'état de bûcher , nous avons conçu une cassette spéciale d'échange d'allèles (Figure 1 A). Les deux régions d'homologie sont de longueurs très différentes, pour tenter de contrôler l'ordre des événements de recombinaison. Une longue région d'homologie correspondant aux 1200 pb immédiatement en aval de bûcher est destiné à diriger le premier événement de recombinaison de sorte qu'une grande majorité de clones à croisement unique soient le résultat d'une recombinaison dans cette région, qui n'inactiverait pas bûcher . Un événement de recombinaison ultérieur dans une seconde région d'homologie beaucoup plus petite correspondant à une partie interne de 300 pb de bûcher exciserait le plasmide, résultant en des cellules à double croisement résistantes au FOA (FOA R ) dans lesquelles le bûcher gène est inactivé et l'insert d'ADN est délivré de manière stable au chromosome.

Intégration de l'ADN au bûcher lieu de C. acetobutylicum . ( UNE ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH12. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH12 et hydA . Les clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH12 et une partie interne de bûcher . Les clones à double croisement sont sélectionnés à l'aide de FOA. ( B ) Criblage par PCR de huit clones candidats à croisement unique à l'aide des amorces lacZa-sF2 et Cac-hydA-sR2, qui s'hybrident au chromosome à croisement unique lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH12 ADN témoin WT, type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–8, clones candidats. Les huit candidats affichent la bande attendue de 1428 pb. ( C ) Criblage par PCR de huit clones candidats à double croisement en utilisant les amorces CAC0026-sF2 et M13F qui s'hybrident au chromosome à double croisement lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH12 ADN témoin WT, type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–8, clones candidats. Les huit candidats affichent la bande attendue de 558 pb. ( ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH14. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH14 et hydA / lacZ . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH14 et la partie correspondante de bûcher . Les clones à double croisement sont sélectionnés en utilisant un milieu de croissance dépourvu d'uracile. ( E ) Criblage par PCR de sept clones candidats à double croisement à l'aide des amorces CAC0026-sF2 et M13F qui s'hybrident au chromosome à double croisement lorsque cela est indiqué en (C). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire 2-Log DNA Ladder (NEB), plasmide pMTL-JH14 ADN témoin 1–7, clones candidats. Des contrôles utilisant l'ADN de deux des bûcher -les clones moins obtenus en (A) sont marqués comme des clones parents. Les sept candidats présentent la bande attendue de 861 pb et les clones parents présentent la bande attendue de 558 pb. Cette augmentation de 303 pb correspond à la restauration du tronc tronqué bûcher gène à pleine longueur.

Intégration de l'ADN au bûcher lieu de C. acetobutylicum . ( UNE ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH12. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH12 et hydA . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH12 et une partie interne de bûcher . Les clones à double croisement sont sélectionnés à l'aide de FOA. ( B ) Criblage par PCR de huit clones candidats à croisement unique à l'aide des amorces lacZa-sF2 et Cac-hydA-sR2, qui s'hybrident au chromosome à croisement unique lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH12 ADN témoin WT, type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–8, clones candidats. Les huit candidats affichent la bande attendue de 1428 pb. ( C ) Criblage par PCR de huit clones candidats à double croisement en utilisant les amorces CAC0026-sF2 et M13F qui s'hybrident au chromosome à double croisement lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH12 ADN témoin WT, type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–8, clones candidats. Les huit candidats affichent la bande attendue de 558 pb. ( ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH14. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH14 et hydA / lacZ . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH14 et la partie correspondante de bûcher . Les clones à double croisement sont sélectionnés en utilisant un milieu de croissance dépourvu d'uracile. ( E ) Criblage par PCR de sept clones candidats à double croisement en utilisant les amorces CAC0026-sF2 et M13F qui s'hybrident au chromosome à double croisement lorsque cela est indiqué en (C). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire 2-Log DNA Ladder (NEB), plasmide pMTL-JH14 ADN témoin 1–7, clones candidats. Des contrôles utilisant l'ADN de deux des bûcher -les clones moins obtenus en (A) sont marqués comme des clones parents. Les sept candidats présentent la bande attendue de 861 pb et les clones parents présentent la bande attendue de 558 pb. Cette augmentation de 303 pb correspond à la restauration de la bûcher gène à pleine longueur.

Nous avons construit le plasmide pMTL-JH12 (figure 1 A), qui comprend la cassette d'échange d'allèles décrite ci-dessus, le marqueur de résistance au chloramphénicol/thiamphénicol chatP et l'origine de la réplication de Bacille plasmide pIM13 (19). Comme plusieurs autres Clostridia et de nombreux autres organismes, C. acetobutylicum n'est pas transformé efficacement par électroporation, il n'est donc généralement pas pratique d'utiliser des plasmides suicides (c'est-à-dire qu'aucune colonie n'apparaît typiquement sur des plaques sélectives après l'électroporation des plasmides suicides). Au lieu de cela, des plasmides réplicatifs sont utilisés, de sorte que les transformants sont facilement obtenus. Le réplicon pIM13 présente une instabilité ségrégationnelle dans C. acetobutylicum (7), et les clones à croisement unique qui apparaissent spontanément au sein des populations transformantes peuvent être isolés par sous-culture sous sélection antibiotique.

Clostridium acetobutylicum les cellules ont été transformées avec l'ADN de pMTL-JH12 et étalées sur un milieu complété de thiamphénicol et d'uracile. Typiquement, 10 à 100 colonies étaient visibles après 24 à 48 h d'incubation, et deux clones de chacune des quatre transformations indépendantes ont été repiqués deux fois sur le même milieu. Les huit clones résultants ont été criblés par PCR, et tous se sont avérés être des clones à croisement unique dans lesquels pMTL-JH12 s'était intégré dans le chromosome via une recombinaison homologue dans la longue région d'homologie, comme prévu (figure 1 B). Ensuite, les huit clones à croisement unique ont été repiqués sur un milieu additionné de FOA et d'uracile pour sélectionner le bûcher -moins les clones à double croisement. Des colonies FOA R ont été obtenues à partir de chacune des huit sous-cultures indépendantes, et un clone de chacune a été purifié en repiquant à nouveau sur le même milieu. Le criblage par PCR a montré le génotype à double croisement attendu pour les huit clones (Figure 1 C), et le placage de répliques sur milieu avec et sans thiamphénicol a confirmé l'absence du plasmide chatP marqueur.

La stratégie décrite ci-dessus remplace efficacement un gène sélectionnable négativement par une séquence d'intérêt, ce qui pourrait être réalisé en utilisant une cassette d'échange d'allèles conventionnelle (14). La différence cruciale est que le bûcher locus d'une souche recombinante construite à l'aide de pMTL-JH12 est spécialement configuré pour faciliter la modification génétique ultérieure ( Figure 1 D). Le non fonctionnel bûcher gène dans ces cellules n'est pas complètement délété, il n'est tronqué qu'à l'extrémité 3'. Recombinaison homologue entre cette partie bûcher gène et une contrepartie partielle appropriée bûcher gène, raccourci à l'extrémité 5', donnerait lieu à un gène fonctionnel complet. Nous avons construit le plasmide pMTL-JH14, qui est presque identique à pMTL-JH12, à l'exception de la partie interne de 300 pb de bûcher qui comprend la petite région d'homologie est immédiatement suivi par le reste de la bûcher séquence codante (Figure 1 D). Comme précédemment, la longue région d'homologie est destinée à diriger l'intégration plasmidique, sans affecter la bûcher phénotype. L'excision ultérieure du plasmide via la région d'homologie courte de 300 pb donnera les clones à double croisement souhaités, spécifiquement sélectionnables par leur bûcher -positif, phénotype prototrophe à l'uracile. Nous avons transformé l'un des précédemment construits bûcher clones mutants de C. acetobutylicum avec l'ADN de pMTL-JH14, ont sélectionné les transformants sur des plaques supplémentées en thiamphénicol et en uracile et les ont repiqués deux fois sur ce milieu. Pour sélectionner bûcher -clones positifs, les cellules ont été repiquées sur milieu dépourvu d'uracile. Sept clones indépendants ont été purifiés et se sont avérés être les doubles croisements prévus par PCR (figure 2 D) et sensibilité au thiamphénicol.

Intégration de l'ADN au thl lieu de C. acetobutylicum . ( UNE ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH31. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH31 et CAC2872/ atpB . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH31 et l'extrémité 3' de thl . Les clones à double croisement sont sélectionnés en utilisant un milieu de croissance dépourvu d'uracile. ( B ) Criblage par PCR de cinq clones candidats à double croisement en utilisant les amorces Cac-thl-sF1 et M13F qui s'hybrident lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH31 ADN témoin WT, de type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–5, clones candidats. Les cinq candidats affichent la bande attendue de 1101 pb. ( C ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH16 contenant adh . Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH16 et CAC2872/ atpB . Les clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH16 et l'extrémité 3' de thl . Les clones à double croisement sont sélectionnés à l'aide d'érythromycine. ( ) Dépistage PCR d'un candidat adh -exprimer un clone à double croisement en utilisant les amorces Cac-thl-sF1 et Cac-atpB-sR1 qui s'hybrident là où indiqué en (C). MW, 2-Log DNA Ladder (NEB) marqueur de poids moléculaire WT, type sauvage C. acetobutylicum contrôle d'ADN génomique qui montre la bande attendue de 1660 pb adh , clone candidat qui montre la bande attendue de 3523 pb. ( E ) Concentrations d'acétone et d'isopropanol dans le surnageant de cultures de type sauvage C. acetobutylicum (WT) ou le adh -exprimant un clone recombinant après 72 h de croissance. Les concentrations des deux produits de fermentation diffèrent significativement entre les deux souches ( P < 0.01).

Intégration de l'ADN au thl lieu de C. acetobutylicum . ( UNE ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH31. Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH31 et CAC2872/ atpB . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH31 et l'extrémité 3' de thl . Les clones à double croisement sont sélectionnés en utilisant un milieu de croissance dépourvu d'uracile. ( B ) Criblage par PCR de cinq clones candidats à double croisement en utilisant les amorces Cac-thl-sF1 et M13F qui s'hybrident lorsque cela est indiqué en (A). MW, plasmide marqueur de poids moléculaire de l'échelle d'ADN 2-Log (NEB), plasmide pMTL-JH31 ADN témoin WT, de type sauvage C. acetobutylicum ADN génomique témoin 1–5, clones candidats. Les cinq candidats affichent la bande attendue de 1101 pb. ( C ) Sélection de clones stables à double croisement en utilisant pMTL-JH16 contenant adh . Le premier événement de recombinaison (intégration plasmidique) est médié par la longue région d'homologie entre pMTL-JH16 et CAC2872/ atpB . Des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Le deuxième événement de recombinaison (excision plasmidique) est médié par la courte région d'homologie entre pMTL-JH16 et l'extrémité 3' de thl . Les clones à double croisement sont sélectionnés à l'aide d'érythromycine. ( ) Dépistage PCR d'un candidat adh -exprimer un clone à double croisement en utilisant les amorces Cac-thl-sF1 et Cac-atpB-sR1 qui s'hybrident là où indiqué en (C). MW, 2-Log DNA Ladder (NEB) marqueur de poids moléculaire WT, type sauvage C. acetobutylicum contrôle d'ADN génomique qui montre la bande attendue de 1660 pb adh , clone candidat qui montre la bande attendue de 3523 pb. ( E ) Concentrations d'acétone et d'isopropanol dans le surnageant de cultures de type sauvage C. acetobutylicum (WT) ou le adh -exprimant un clone recombinant après 72 h de croissance. Les concentrations des deux produits de fermentation diffèrent significativement entre les deux souches ( P < 0.01).

Il serait utile d'appliquer la stratégie ci-dessus pour Clostridium spp. autre que C. acetobutylicum . Nous avons construit des plasmides équivalents à pMTL-JH12 et pMTL-JH14 pour C. sporogènes NCIMB 10696, qui montre un potentiel dans de nouvelles thérapies tumorales (20) et la souche 630Δ euh de l'important pathogène humain C. difficile ( 21 ) ( Tableau 1 ). Les clones à double croisement de ces deux organismes pourraient être sélectionnés à l'aide d'un milieu supplémenté en FOA, comme décrit dans les données supplémentaires et illustré dans la figure supplémentaire S2. Intégration à la pyrF lieu de C. acetobutylicum , y compris les insertions de fragments d'ADN de phage lambda de différentes tailles, est également décrite dans les données supplémentaires et illustrée dans la figure supplémentaire S1 .

Couplage de l'expression de marqueurs sélectionnables hétérologues à un promoteur chromosomique

Utilisation du plasmide pMTL-JH14 dans le bûcher mutant construit en utilisant pMTL-JH12, nous avions fusionné efficacement deux bûcher gènes pour aboutir à un ensemble complet et fonctionnel bûcher gène par recombinaison au milieu de la séquence codante. Nous avons réalisé qu'un événement de recombinaison réunissant deux gènes partiels pour former un gène entier n'avait pas besoin de se produire dans la séquence codante. Dans un arrangement alternatif, la séquence codante pleine longueur d'un marqueur sélectionnable, ne manquant qu'un promoteur, pourrait être liée par recombinaison à un promoteur situé sur le chromosome, complétant le gène et conduisant à son expression. Nous avons conçu le plasmide pMTL-JH31 (Figure 2 A) pour mettre en œuvre ce concept modifié en intégrant un bûcher gène dépourvu de son propre promoteur dans le chromosome du bûcher mutant de C. acetobutylicum . L'insertion a été ciblée sur un site en aval de la thiolase ( thl ), qui est connu pour présenter une forte expression tout au long de la croissance (22, 23). Pour éviter une éventuelle recombinaison homologue au bûcher locus, pMTL-JH31 utilise l'orthologue bûcher gène de C. sporogènes ATCC 15579, qui n'est identique qu'à 47,6 % à la C. acetobutylicum gène. Comme précédemment, une longue région d'homologie (1200 pb) dirige l'intégration du plasmide sans altérer le bûcher phénotype, et des clones à croisement unique sont obtenus sur milieu contenant du thiamphénicol. Par la suite, l'excision plasmidique médiée par une deuxième région d'homologie place le silence (non exprimé) bûcher gène immédiatement en aval de la thl gène sur le chromosome, conduisant à sa co-expression avec thl , et permettant à ces clones à double croisement d'être sélectionnés sur un milieu dépourvu d'uracile (Figure 2 A). Pour tester ce schéma, nous avons transformé le bûcher mutant de C. acetobutylicum avec l'ADN de pMTL-JH31, et effectué la procédure d'intégration comme décrit ci-dessus pour pMTL-JH14. Cinq clones indépendants ont été criblés par PCR (Figure 2 B) et sensibilité au thiamphénicol, et tous ont été vérifiés, confirmant l'utilité de cette approche modifiée.

L'utilisation de la recombinaison pour lier un promoteur chromosomique à un marqueur sélectionnable dans une cassette d'échange d'allèles représente une stratégie très flexible, qui ne se limite pas à la restauration d'un mutant auxotrophe en prototrophie. Nous avons construit pMTL-JH16, qui est identique à pMTL-JH31, à l'exception du site de liaison au ribosome et de la séquence codante de bûcher sont remplacés par ceux du marqueur de résistance aux antibiotiques macrolide–lincosamide–streptogramine (MLS) euhB (24). Comme précédemment, une longue région d'homologie (1200 pb) dirige l'intégration du plasmide. Ensuite, l'événement de recombinaison médiateur des positions d'excision de plasmide euhB immédiatement en aval de thl , menant à euhB expression et un phénotype résistant au MLS qui peut être utilisé pour sélectionner spécifiquement des clones à double croisement (Figure 2 C). Nous avons testé pMTL-JH16 dans le type sauvage C. acetobutylicum en utilisant une procédure d'intégration similaire à celle précédente, en cultivant les transformants initialement sur du thiamphénicol, et ont été facilement capables de sélectionner spécifiquement des clones à double croisement en utilisant l'antibiotique macrolide érythromycine. Six clones recombinants ont été criblés de la même manière que précédemment, et tous ont été confirmés comme étant les recombinants souhaités (données non présentées).

Intégration et expression d'une alcool déshydrogénase

Dans la stratégie précédente, l'expression de gènes marqueurs hétérologues était couplée à la formation d'un chromosome recombinant à double croisement, fournissant un moyen de sélectionner ces clones. Ensuite, nous avons cherché à étendre ce principe à l'expression d'autres gènes hétérologues d'intérêt, à d'autres fins. Outre le butanol, les autres produits majeurs de la fermentation du sucre par C. acetobutylicum sont l'acétone et l'éthanol, et le processus est souvent appelé fermentation acétone-butanol-éthanol (ABE) (25). Le butanol est le produit le plus précieux, mais l'éthanol a également une valeur à la fois en tant que produit chimique de base et en tant que biocarburant. L'acétone a moins de valeur et ne convient pas comme combustible, elle représente donc un sous-produit indésirable ou un déchet du procédé industriel ABE. Clostridium beijerinckii NRRL B593 has a similar physiology to C. acetobutylicum , but reduces the acetone it produces to isopropanol (propan-2-ol) using an NADPH-dependent primary/secondary alcohol dehydrogenase ( 26 ). Isopropanol is more valuable than acetone, and could be used as biofuel in a blend with butanol and ethanol, so it would be useful to add the adh gene which encodes this activity to C. acetobutylicum .

We inserted the coding sequence of adh into pMTL-JH16 along with a ribosome-binding site, but did not provide a promoter ( Figure 2 C). Double-crossover recombinants will therefore contain an artificial thl - ermB - adh operon, with all three genes dependent upon the thl promoter for expression. The integration procedure was performed as before, and double-crossover clones were selected using erythromycin. We picked only one clone of the many obtained to screen for integration of adh , because the experiments described in the previous sections suggested that screening multiple clones was unnecessary. Les adh -containing clone was verified as before by PCR ( Figure 2 D) and thiamphenicol sensitivity. We compared the fermentation products of the adh -containing clone to the wild-type using anaerobic batch cultivation conditions under which C. acetobutylicum exhibits classic bi-phasic growth, switching from organic acid production to acid re-uptake and solvent production as it enters stationary phase. After 72 h growth, supernatants of wild-type cultures contained typical concentrations of fermentation products, including 91.9 ± 8.4 mM butanol, 52.9 ± 4.7 mM acetone and 12.6 ± 1.5 mM ethanol. At the same timepoint, supernatants from cultures of the adh clone contained 15.4 ± 3.1 mM acetone and 27.9 ± 6.7 mM isopropanol ( Figure 2 E). None of the other fermentation product concentrations differed significantly from the wild-type. This result demonstrates expression of functional adh , and the recombinant strain represents an improvement over the wild-type from an industrial perspective.

Multistep integration of the phage lambda genome

Up to 1.8 kb of heterologous DNA was integrated in the experiments described above, and larger fragments of up to 6.5 kb were integrated in additional experiments described in the Supplementary Data . However, there must be limits to the size of DNA that can be delivered in a single step. Pour C. acetobutylicum , this limitation may well be imposed by the frequency of transformation, which is low even for small plasmids ( 7 ). Sequences too large to be integrated in a single step could be delivered in a series of steps using overlapping subfragments of the desired sequence, as in the domino method for Bacillus subtilis ( 3 ). This might be achieved either by alternately switching on and off a positively and negatively selectable gene such as pyrE ( Figure 1 ) or by alternately linking expression of two different heterologous selectable markers to a chromosomal promoter ( Figure 2 ). In either scheme, the short region of homology would remain the same in every step, whereas the long region of homology would target the end of the previous insert in the second and subsequent steps.

To test multistep DNA delivery using ACE, we attempted to insert the entire genome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . We identified three restriction fragments of circular phage lambda DNA (circularized by ligation of the cohesive ends of the linear chromosome) that covered the entire genome and provided regions of overlap suitable to direct the initial recombination events in the second and third ACE steps ( Figure 3 ). We used restriction ligation cloning to insert the 28 kb fragment (L28), 18 kb fragment (L18) and 6.5 kb fragment (L6.5) into ACE vectors pMTL-JH16, pMTL-JH30 and pMTL-JH15, respectively. Vectors pMTL-JH30 and pMTL-JH15 are similar to pMTL-JH31 and pMTL-JH16, but do not include a long region of homology, so these vectors are appropriate when the long region of homology depends upon a previous step, and must therefore be provided with the insert or as part of the insert ( Table 1 ). When we inserted L18 into pMTL-JH30, we obtained clones with deletions in the lambda sequence. It appears that cloning this region (which includes lysis genes) into pMTL-JH30 is toxic to E. coli , so clones with spontaneous deletions are selected. In one of these constructs, 6 kb of DNA is deleted, but the regions required for recombination between fragments are not affected. We used this 12 kb of lambda DNA (L12) instead of L18, and proceeded to the multistep integration.

Multistep insertion of the chromosome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . ( UNE ) Chromosome of phage lambda showing restriction sites used to excise the three overlapping fragments. Yellow, 28 kb XmaI-XmaI fragment L28 blue, 18 kb NheI-AscI fragment L18 green, 6.5 kb XmaI-XhoI fragment L6.5 white, regions of overlap between fragments cross-shaded deletion, 6 kb region of L18 absent from L12 coh , ligated cohesive ends. ( B ) Integration plasmids pMTL-JH16::L28, pMTL-JH30::L12 and pMTL-JH15::L6.5. The lambda sequences are colored as in (A). Gray arrows e et p , inactive (non-expressed) ermB et pyrE , respectively black, homology to thl locus E, EcoRI sites dashed lines, EcoRI fragments (except those spanning the plasmid backbone) numeric labels, EcoRI fragment lengths in kilo base pair. (C) Les thl locus of C. acetobutylicum before and after 1, 2 and 3 insertions of lambda DNA. Elements are labeled as in (B). The first recombination event at each step, indicated, is directed by a long region of homology. A short region of homology mediates plasmid excision and simultaneously activates ermB ou pyrE in alternate steps, shown by red arrows e et p , respectively, by positioning them under the control of the chromosomal thl promoteur. ( ) Southern blot of EcoRI digests of the plasmids and chromosomes shown in (B) and (C), using lambda DNA as probe. MW, HindIII-digested lambda DNA molecular weight marker.

Multistep insertion of the chromosome of phage lambda into the chromosome of C. acetobutylicum . ( UNE ) Chromosome of phage lambda showing restriction sites used to excise the three overlapping fragments. Yellow, 28 kb XmaI-XmaI fragment L28 blue, 18 kb NheI-AscI fragment L18 green, 6.5 kb XmaI-XhoI fragment L6.5 white, regions of overlap between fragments cross-shaded deletion, 6 kb region of L18 absent from L12 coh , ligated cohesive ends. ( B ) Integration plasmids pMTL-JH16::L28, pMTL-JH30::L12 and pMTL-JH15::L6.5. The lambda sequences are colored as in (A). Gray arrows e et p , inactive (non-expressed) ermB et pyrE , respectively black, homology to thl locus E, EcoRI sites dashed lines, EcoRI fragments (except those spanning the plasmid backbone) numeric labels, EcoRI fragment lengths in kilo base pair. (C) Les thl locus of C. acetobutylicum before and after 1, 2 and 3 insertions of lambda DNA. Elements are labeled as in (B). The first recombination event at each step, indicated, is directed by a long region of homology. A short region of homology mediates plasmid excision and simultaneously activates ermB ou pyrE in alternate steps, shown by red arrows e et p , respectively, by positioning them under the control of the chromosomal thl promoteur. ( ) Southern blot of EcoRI digests of the plasmids and chromosomes shown in (B) and (C), using lambda DNA as probe. MW, HindIII-digested lambda DNA molecular weight marker.

We integrated each of the three lambda DNA fragments in turn into the chromosome of the pyrE mutant of C. acetobutylicum ( Figure 3 ). Double-crossover clones were selected using erythromycin ( ermB +) for the L28 insertion, then medium lacking uracil ( pyrE +) for the L12 insertion, then erythromycin again for the L6.5 insertion. At each step, the insertion was initially verified by thiamphenicol sensitivity and PCR. After all three insertions were completed, a Southern blot of EcoRI-digested genomic DNA from the three recombinant strains (containing one, two or three lambda DNA insertions) was performed, using lambda DNA as the probe ( Figure 3 D). EcoRI-digested genomic DNA from the parental pyrE mutant strain was also included, as was EcoRI-digested plasmid DNA of the three integration plasmids. All samples showed the expected distinguishing pattern of fragments (none in the case of the pyrE strain control) confirming the successful multistep insertion. The insertions were also verified by sequencing.


Linking plasmid-based beta-lactamases to their bacterial hosts using single-cell fusion PCR

The horizonal transfer of plasmid-encoded genes allows bacteria to adapt to constantly shifting environmental pressures, bestowing functional advantages to their bacterial hosts such as antibiotic resistance, metal resistance, virulence factors, and polysaccharide utilization. However, common molecular methods such as short- and long-read sequencing of microbiomes cannot associate extrachromosomal plasmids with the genome of the host bacterium. Alternative methods to link plasmids to host bacteria are either laborious, expensive or prone to contamination. Here we present the One-step Isolation and Lysis PCR (OIL-PCR) method, which molecularly links target ARGs with the bacterial 16S rRNA gene via fusion PCR performed within an emulsion. After validating this method, we apply it to identify the bacterial hosts of three clinically relevant beta-lactamases in a neutropenic patient population who are particularly vulnerable multidrug-resistant infections. We detect novel associations of two low-abundance genera, Romboutsia et Agathobacter, with a multi-drug resistant plasmid harbored by Klebsiella pneumoniae. We put forth a robust, accessible, and high-throughput platform for sensitively surveying the bacterial hosts of mobile genes in complex microbial communities.


Plasmid Vectors for in vivo Selection-Free Use with the Probiotic E. coli Nisslé 1917

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is a probiotic bacterium, commonly employed to treat certain gastrointestinal disorders. It is fast emerging as an important target for the development of therapeutic engineered bacteria, benefiting from the wealth of knowledge of E. coli biology and ease of manipulation. Bacterial synthetic biology projects commonly utilize engineered plasmid vectors, which are simple to engineer and can reliably achieve high levels of protein expression. However, plasmids typically require antibiotics for maintenance, and the administration of an antibiotic is often incompatible with in vivo experimentation or treatment. EcN natively contains plasmids pMUT1 and pMUT2, which have no known function but are stable within the bacteria. Here, we describe the development of the pMUT plasmids into a robust platform for engineering EcN for in vivo experimentation, alongside a CRISPR-Cas9 system to remove the native plasmids. We systematically engineered both pMUT plasmids to contain selection markers, fluorescent markers, temperature sensitive expression, and curli secretion systems to export a customizable functional material into the extracellular space. We then demonstrate that the engineered plasmids were maintained in bacteria as the engineered bacteria pass through the mouse GI tract without selection, and that the secretion system remains functional, exporting functionalized curli proteins into the gut. Our plasmid system presents a platform for the rapid development of therapeutic EcN bacteria.

Mots clés: microbiome probiotic engineering synthetic biology.

Déclaration de conflit d'intérêts

The authors declare the following competing financial interest(s): Authors have filed a provisional patent application based on the work presented in this paper.


The discovery of toxin-antitoxin systems

Toxin-antitoxin systems were first discovered in 1983 when Teru Ogura and Sota Hiraga found that if a mini-F plasmid carried a specific 700 bp segment of DNA, the plasmid was propagated better than plasmids without this DNA.

They eventually designated this fragment as the ccdB region (for “ c oupled c aune ivision”). The encoded toxin-antitoxin system consists of CcdB (toxin) and CcdA (antitoxin) where CcdB inferes with DNA replication by binding the GyrA subunit of DNA gyrase and trapping it in the cleaved complex. This results in DNA breakage and cell death. Conversely, CcdA binds to and blocks the activity of CcdB.


Can bacteria grow without a plasmid or am i stupid? - or did ampicillin wear out? (Jun/20/2007 )

I am trying to clone PCR products in to TOPO vector. I am using Invitrogen TOPO-TA cloning kit. its the PCR4-TOPO. The problem is, i ligated the pcr product in to topo vector, transformed (here i used a control plasmid too i.e. puc19) and grow the bacteria. I saw colonies the next day in the pcu19 control (where the number of colonies are more) and the pcr ligated topo plates. The plates have 100ug/ml ampicilin. Then i grow the culture in liquid LB ON at 37 deg in 5 ml and tried to do miniprep (i am using quick plasmid kit from invitrogen) to extract plasmid and ran the gel, i am seeing bands only in the puc19 controls and not in the pcr ligated sample lane. I am also seeing a very faint band in both puc19 control and sample at 12kb. could it be genomic DNA? How could bacteria grow with out plasmid? or am i missing something here? Please help me

Ampicilin degrade with time. Ampicilin also degrades faster when exposed to high temperature. Was the Amp stocks defrosted using high temperature, or perhaps were the plates old?

I wouldn't use plates more then 2 weeks old.

quite true, As ampicillin degrades, this promotes growth of the all bacteria which don't have the resistance gene.

You could check your plates by streaking out untransformed competent E. coli, which should give you no colonies if your plates (and competent cells too) are OK.


Voir la vidéo: Bacteria are our friends. Beneficial bacteria in the intestine - the basis of immunity and health (Février 2023).