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Comment le P450 peut-il faire la distinction entre les composés étrangers et natifs ?

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Je crois comprendre que les enzymes P450 sont capables de dégrader sélectivement les composés qui pénètrent dans la cellule depuis l'extérieur (par exemple, les drogues synthétiques) sans endommager les composés qui sont des intermédiaires métaboliques normalement présents dans les cellules. Quel est le mécanisme qui permet à ces enzymes de distinguer les composés étrangers qui sont des substrats des intermédiaires métaboliques normaux qui ne sont pas des substrats, s'ils sont structurellement similaires ?


Fausse Prémisse

La fausse prémisse de cette question réside dans la fin de la dernière phrase :

… la capacité de distinguer les composés étrangers qui sont des substrats des intermédiaires métaboliques normaux qui ne sont pas des substrats, s'ils sont structurellement similaires

L'hypothèse ici semble être que la similitude entre les intermédiaires métaboliques normaux et les composés étrangers est trop grande pour qu'une discrimination se produise. Il n'y a aucune raison de supposer cela.

Explication

La spécificité de substrat des enzymes P450 qui métabolisent les xénobiotiques est telle qu'elles ne métabolisent pas les constituants cellulaires normaux.

Il existe de nombreuses preuves que les enzymes peuvent avoir une spécificité de substrat qui est soit extrêmement étroite, soit relativement large. Cela dépend évidemment de la structure du site de liaison au substrat - sa forme et sa taille et la nature chimique des résidus d'acides aminés qui s'y trouvent. En pensant en ces termes, on peut envisager une enzyme qui distinguera les substrats avec un seul substituant à une position particulière, mais métabolisera une variété de composés similaires qui en sont dépourvus. L'évolution des enzymes P450 peut être imaginée comme un processus par lequel les mutations qui permettent le métabolisme de composés environnementaux toxiques apporteraient un avantage et seraient sélectionnées, mais les mutations qui perturberaient le métabolisme normal seraient mortelles (ou désavantageuses) et seraient sélectionnées contre.

Le contexte plus large des enzymes P450

La question est posée en des termes qui pourraient suggérer que la seule fonction des enzymes P450 est l'élimination des xénobiotiques, et peut-être qu'ils ne sont qu'une caractéristique des organismes supérieurs. En fait, ni l'un ni l'autre n'est vrai. Les détails de leur apparition dans les bactéries peuvent être trouvés dans l'article de Wikipedia. Cependant, un article que j'ai, en tant que non-expert, trouvé intéressant à cet égard a été publié par Kawashima et Satta dans PLOS ONE en 2014. Cela montre qu'il existe deux classes de gènes P450 - ceux impliqués dans la biosynthèse cellulaire normale ( par exemple les stéroïdes, les cholestérols, la vitamine D3 et les acides biliaires) et ceux actifs contre les xénobiotiques (par exemple les alcaloïdes végétaux, les composés aromatiques et les acides gras). La comparaison des gènes de ceux-ci chez une variété de vertébrés (principalement) implique que ceux impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques ont évolué à partir de ceux impliqués dans le métabolisme cellulaire normal, et ces gènes de détoxification sont apparus non pas une seule fois, mais à plusieurs reprises.


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    • Auteurs : Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Éditeur/site Web : OpenStax
    • Titre du livre : Biologie pour les cours AP®
    • Date de parution : 8 mars 2018
    • Lieu : Houston, Texas
    • URL du livre : https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • URL de la section : https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/38-critical-thinking-questions

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    Finzi, A.A., Latini, R., Barlera, S., Rossi, M.G., Ruggeri, A., Mezzani, A., et al. (2011). Les effets de m-3 acides gras polyinsaturés sur les arythmies ventriculaires malignes chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque chronique et de défibrillateurs cardiaques implantables : une sous-étude de l'essai Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Insufficienza Cardiaca (GISSI-HF). Journal américain du cœur, 161, 338–343.

    Arnold, C., Markovic, M., Blossey, K., Wallukat, G., Fischer, R., Dechend, R., et al. (2010). Les enzymes du cytochrome P450 métabolisant l'acide arachidonique sont des cibles des acides gras w-3. Journal de chimie biologique, 285, 32723–32733.

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    Madden, J., Williams, C.M., Calder, P.C., Lietz, G., Miles, E.A., Cordell, H., et al. (2011). L'impact des variantes génétiques communes sur la réponse des biomarqueurs du risque de maladie cardiovasculaire (MCV) à l'augmentation des apports en acides gras d'huile de poisson. Revue annuelle de la nutrition, 31, 203–234.

    Bazan, H.A., Lu, Y., Thoppil, D., Fitzgerald, T.N., Hong, S., & Dardik, A. (2009). Une diminution des acides gras oméga-3 est associée aux plaques carotidiennes des patients neurologiquement symptomatiques : Implications pour les interventions carotidiennes. Pharmacologie vasculaire, 51, 331–336.

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    Caractérisation moléculaire et fonctionnelle du CYP6BQ23, un cytochrome P450 conférant une résistance aux pyréthroïdes dans les populations européennes de coléoptère, Meligethes aeneus

    Le coléoptère (Meligethes aeneus F.) est répandu dans une grande partie de l'Europe où il est un important coléoptère ravageur du colza (Brassica napus). Le recours aux insecticides synthétiques pour le contrôle, en particulier la classe des pyréthroïdes, a conduit au développement de populations présentant des niveaux élevés de résistance. La résistance aux pyréthroïdes est maintenant répandue dans toute l'Europe et on pense qu'elle est médiée par une détoxification accrue par le cytochrome P450ś et/ou une mutation du site cible des pyréthroïdes, le canal sodique voltage-dépendant. Cependant, dans le cas de la détoxification médiée par le cytochrome P450, la ou les enzymes spécifiques impliquées n'ont pas encore été identifiées. Dans cette étude, une approche PCR dégénérée a été utilisée pour identifier dix séquences partielles du gène P450 du coléoptère pollinique. La PCR quantitative a ensuite été utilisée pour examiner le niveau d'expression de ces gènes dans une gamme de populations de coléoptères qui ont montré différents niveaux de résistance aux pyréthroïdes dans les essais biologiques. L'étude a révélé un seul gène P450, CYP6BQ23, qui est significativement et fortement surexprimée (jusqu'à ∼ 900 fois) chez les adultes et les larves de souches résistantes aux pyréthroïdes par rapport aux souches sensibles. CYP6BQ23 la surexpression est significativement corrélée à la fois au niveau de résistance et au taux de métabolisme de la deltaméthrine dans les préparations microsomales de ces populations. L'expression recombinante fonctionnelle du CYP6BQ23 de pleine longueur avec la cytochrome P450 réductase dans une lignée cellulaire d'insecte (Sf9) a montré qu'elle est capable de métaboliser efficacement la deltaméthrine en 4-hydroxy deltaméthrine. De plus, nous avons démontré par la détection de 4-hydroxy tau-fluvalinate utilisant ESI-TOF MS/MS qui exprime fonctionnellement le CYP6BQ23 métabolise également tau-fluvalinate. Un modèle de protéine a été généré et des simulations d'amarrage ultérieures ont révélé le mode de liaison au substrat prédit de la deltaméthrine et tau-fluvalinate au CYP6BQ23. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que la surexpression de CYP6BQ23 est le principal mécanisme conférant une résistance aux pyréthroïdes dans les populations de coléoptères dans une grande partie de l'Europe.

    UNE cis-séquence régulatrice conduisant la résistance métabolique aux insecticides chez les moustiques : Caractérisation fonctionnelle et signatures de sélection

    Bien que les enzymes du cytochrome P450 (CYP450) soient fréquemment régulées à la hausse chez les moustiques résistants aux insecticides, aucun motif régulateur à l'origine de ces différences d'expression en rapport avec les populations sauvages n'a été identifié. Les éléments transposables (ET) sont souvent enrichis en amont des CYP450 impliqués dans la résistance aux insecticides, ce qui laisse supposer qu'ils contribuent aux motifs régulateurs qui sous-tendent directement le phénotype de résistance. Un partiel CuRE1 (Culex Rrépétitif Eélément 1) l'élément transposable se trouve directement en amont de CYP9M10, un cytochrome P450 impliqué précédemment dans la résistance larvaire à la perméthrine chez la souche ISOP450 de Culex quinquefasciatus, mais est absent de la région génomique équivalente d'une souche sensible. Passant par expression du CYP9M10 dans Escherichia coli nous avons maintenant démontré le métabolisme de la perméthrine dépendant du temps et du NADPH, conditions préalables à la confirmation d'un rôle dans la résistance métabolique, et par qPCR montré que CYP9M10 est >20 fois surexprimé dans ISOP450 par rapport à une souche sensible. Dans un essai de reporter fluorescent, la région en amont de CYP9M10 d'ISOP450 a conduit l'expression 10× par rapport à la région équivalente (manquant CuRE1) de la souche sensible. Une correspondance étroite avec le changement de pli d'expression génique implique la région en amont, y compris CuRE1 comme un cis-élément régulateur impliqué dans la résistance. Un seul CuRE1 allèle porteur, identique au CuRE1 porteur de l'allèle dans la souche résistante, se trouve dans toute l'Afrique sub-saharienne, contrairement à la diversité rencontrée dans les non-CuRE1 allèles. Cela suggère une origine unique et une propagation ultérieure en raison d'un avantage sélectif. CuRE1 est détectable à l'aide d'un diagnostic simple. Lorsqu'il est appliqué à C. quinquefasciatus des larves du Ghana, nous avons démontré une association significative avec la résistance à la perméthrine dans plusieurs sites de terrain (rapport de cotes moyen = 3,86), ce qui suggère que ce marqueur est pertinent pour les populations naturelles de moustiques vecteurs. Cependant, quand CuRE1 a été excisé de l'allèle utilisé dans le test rapporteur par PCR de fusion, l'expression n'a pas été affectée, indiquant que le TE n'a pas de rôle direct dans la résistance et donc que CuRE1 n'agit que comme marqueur d'un motif régulateur non encore identifié dans l'analyse d'association. Cela suggère qu'une réévaluation de l'hypothèse selon laquelle les ET contribuent aux motifs régulateurs impliqués dans l'expression des gènes peut être nécessaire.


    OXYDATION OMEGA : UNE PISTE MENANT À LA RÉSOLUTION ET À LA RECONSTITUTION DU SYSTÈME ENZYME FOIE MICROSOMAL CONTENANT P450

    Bien que la plupart des oxydations biologiques se produisent selon les prédictions de principes chimiques connus, celles qui ne le sont pas impliquent souvent des cofacteurs particulièrement intéressants, tels que des métaux ou des coenzymes organiques insoupçonnés auparavant. Dans d'autres cas, de nouvelles fonctions des résidus d'acides aminés dans les enzymes sont découvertes, modifiant ainsi nos concepts de catalyse biologique. J'ai longtemps été intrigué par les oxydations difficiles de groupes alkyles non fonctionnalisés, comme la conversion de la chaîne latérale de la leucine en acétoacétate (comme décrit ci-dessus) l'anabolisme et le catabolisme de lipides peu solubles la dégradation de produits naturels tels que les terpénoïdes et les transformations de certaines substances « étrangères » chimiquement non réactives telles que les médicaments, les solvants et les pesticides à des produits qui peuvent être plus ou moins toxiques que leurs précurseurs. Même les alcanes hautement inertes du pétrole sont connus depuis de nombreuses années pour subir une oxydation microbienne.

    À la fin des années 1950, j'ai choisi la ω-oxydation des acides gras, dans laquelle l'attaque se produit à la position la moins réactive, le groupe méthyle terminal, comme modèle pour des oxydations aussi difficiles. En 1932, Verkade et al. (9) aux Pays-Bas avaient découvert cette conversion inattendue lorsqu'ils ont donné des acides gras de longueur de chaîne intermédiaire à des chiens et à des volontaires humains et ont isolé les acides dicarboxyliques urinaires résultants. Halina Den, une étudiante diplômée de mon laboratoire, a pu montrer qu'un acide gras ,α-diméthyl-substitué marqué au 14 C subissait une oxydation terminale dans le tissu hépatique (10), mais l'instabilité et l'insolubilité du système enzymatique empêchaient davantage le progrès.

    Nous nous sommes ensuite tournés vers l'oxydation microbienne des hydrocarbures en tant que substrats encore plus inertes. Un associé postdoctoral de l'Illinois, James Baptist, a isolé à partir d'échantillons de sol une souche de Pseudomonas oleovorans, surnommée la « punaise de l'essence » par nos confrères, qui poussait bien sur des alcanes comme l'hexane. Des extraits acellulaires ont rapidement été obtenus qui nécessitaient du NADH pour la conversion aérobie de l'octane en octanol (11, 12) et, d'un intérêt particulier, la -oxydation des acides gras comme l'ont démontré Masamichi Kusunose et sa femme Emi, des visiteurs du Japon ( 13). Après la résolution réussie du système enzymatique en trois fractions enzymatiques par Bill Peterson (14), les composants ont finalement été purifiés et caractérisés comme de la rubrédoxine, une protéine de fer rouge non hémique (15) connue auparavant uniquement pour se produire dans les bactéries anaérobies, une flavoprotéine contenant du FAD et fonctionnant comme NADH-rubredoxine réductase qui a été caractérisée par Tetsufumi (Ted) Ueda (16, 17) et la -hydroxylase, une protéine presque incolore qui s'agrégeait abondamment et était activée par l'ajout d'ions ferreux (18, 19). Les propriétés de l'hydroxylase bactérienne en ont fait un candidat difficile pour d'autres études mécanistiques, mais elle a continué à être étudiée par d'autres, qui ont établi qu'elle contient un amas de diiron non hémique (20).

    Dans l'espoir que nos découvertes sur les bactéries seraient applicables au métabolisme des mammifères, nous sommes revenus au système hépatique que nous avions abandonné environ dix ans auparavant. Heureusement, Anthony Lu a rejoint mon groupe de recherche en 1966 en tant qu'associé postdoctoral à la fin de ses études supérieures en biochimie à l'Université de Caroline du Nord. J'ai immédiatement eu l'impression que ce jeune scientifique extrêmement compétent méritait d'être confronté à un problème suffisamment stimulant. Je doute d'avoir clairement indiqué à quel point le système microsomal hépatique serait difficile, mais je lui ai conseillé de commencer par les méthodes qui avaient réussi avec la pseudomonade. Le manque de succès de cette approche n'a découragé aucun de nous, pas plus que le manque de connaissances à l'époque sur les enzymes membranaires. Après plus de deux ans, les efforts dévoués d'Anthony ont finalement abouti à la solubilisation du système de -hydroxylation microsomale du foie de lapin catalytiquement actif par l'utilisation de divers détergents avec du glycérol et d'autres agents pour empêcher la dénaturation des enzymes. Comme il est maintenant bien connu, la chromatographie sur colonne échangeuse d'ions a résolu le système en trois composants qui, lors de la recombinaison dans des conditions contrôlées, ont catalysé la -hydroxylation de l'acide laurique marqué au 14C (21, 22). Comme le montre la figure 1, ceux-ci comprenaient une fraction brun rougeâtre que nous avons rapidement identifiée, à notre grande surprise et à notre grand plaisir, comme le cytochrome P450 par le changement spectral lors de la réaction avec le monoxyde de carbone après réduction du dithionite, et une fraction jaune contenant du NADPH-cytochrome P450 réductase qui était pleinement active dans le transfert d'électrons vers P450, contrairement aux préparations isolées par d'autres après solubilisation par traitement à la protéase, avec perte du peptide hydrophobe au niveau du NH2-terminus. La troisième fraction contenait un composant actif incolore, thermostable et extractible par des solvants organiques. Il a été découvert plus tard par Henry Strobel, un autre associé postdoctoral talentueux de Caroline du Nord, qu'il contenait des phospholipides microsomaux, dont la phosphatidylcholine était le plus efficace (23). Ainsi, nous avions entre les mains le système enzymatique solubilisé et reconstitué qui allait nous permettre de purifier et de caractériser les enzymes impliquées. Une variété de médicaments, y compris l'aminopyrine, la benzphétamine, l'hexobarbital, l'éthylmorphine, la norcodéine et p-nitroanisole, se sont également avérés être oxydés par le système reconstitué (24), et, très intéressant, Robert Kaschnitz (25) et Wilfried Duppel & Jean-Michel Lebeault (26) ont constaté que les mêmes méthodes utilisées avec le foie de lapin étaient efficaces avec du foie humain et avec Candida tropicalis, respectivement. Nos résultats ont été grandement facilités par les connaissances antérieures selon lesquelles le pigment microsomal de liaison au CO de fonction inconnue (27-29) avait été caractérisé comme un b cytochrome de type par Omura & Sato (30). De plus, il était connu que ce catalyseur dans les microsomes hépatiques est impliqué dans l'hydroxylation de plusieurs stéroïdes et médicaments, comme cela a été établi dans les expériences pionnières de spectroscopie d'action photochimique par Omura et al. en 1965 (31).

    Dans sa conférence Bernard Brodie Award, Anthony Lu (32 ans) a également commenté notre connaissance limitée des enzymes liées à la membrane au début et le défi de travailler sur le cytochrome P450 des mammifères. Pour indiquer les nombreuses questions importantes en suspens à ce moment-là, un bref résumé des actes du premier Symposium sur les microsomes et les oxydations de médicaments tenu à Bethesda, Maryland, en 1968 (33) est en ordre. L'idée est venue du Comité sur la sécurité des médicaments, Conseil de recherche sur les médicaments de l'Académie nationale des sciences. Organisé par James Gillette, un expert en pharmacologie biochimique, et d'autres scientifiques éminents, dont Allan Conney, George Cosmides, Ronald Estabrook, James Fouts et Gilbert Mannering, le programme comprenait 27 conférences données par des experts du monde entier sur la morphologie microsomale et ce qui était connu sur le métabolisme des médicaments. (Les affiches n'avaient pas encore été inventées.) Les propriétés du réticulum endoplasmique ont été décrites et des preuves ont été présentées qu'environ 20 composés, comprenant plusieurs médicaments, stéroïdes et hydrocarbures, ainsi que des acides gras (34), subissent une oxydation dans les microsomes hépatiques. à partir d'animaux de laboratoire. Hydroxylation, y compris médicament N-déméthylation, était la seule réaction envisagée. Le monoxyde de carbone et le SKF-525A étaient les inhibiteurs mentionnés, et le phénobarbital et le 3-méthylcholanthrène les deux principaux inducteurs. Un débat s'est ensuivi sur le nombre de «formes» de P450 existant, un camp ne croyant en qu'une seule enzyme. La proposition intéressante a également été faite sur la base des effets des inducteurs sur les activités et les spectres des microsomes hépatiques isolés des animaux traités pour deux types de pigments fixant le CO, ou éventuellement deux formes interconvertibles d'un seul cytochrome. En ce qui concerne l'oxydant actif produit par le P450, l'oxène, analogue au composé I des peroxydases, a été proposé. Tous les participants ont convenu que le domaine très intrigant du métabolisme des médicaments était au seuil d'un progrès majeur.

    Ce chapitre préliminaire concerne mes intérêts de recherche qui ont conduit notre laboratoire à étudier les aspects biochimiques du métabolisme des médicaments, et aucune tentative n'est faite pour fournir une revue générale de ce qui est devenu un immense domaine d'activité. Cependant, il convient de mentionner les contributions exceptionnelles du laboratoire Gunsalus avec le P450cam bactérien, un cytochrome non membranaire spécifique de l'oxydation du camphre (35, 36) et qui a servi de modèle pour les P450 mammifères polyvalents mais moins traitables.Les lecteurs intéressés par les développements dans ce domaine au fil des ans sont renvoyés aux actes de plusieurs séries de réunions internationales, toutes mettant l'accent sur la science fondamentale : Symposia on Microsomes and Drug Oxidations, comme déjà mentionné Conférences sur la biochimie et la biophysique du cytochrome P450 ( 37), créé en 1976 par Klaus Ruckpaul, qui travaillait à Berlin-Buch pour surmonter les barrières qui séparaient l'Europe de l'Est et de l'Ouest depuis la fin de la Seconde Guerre mondiale, et dont les vaillants efforts dans cette entreprise ont attiré un soutien mondial, comme l'a reconnu Sinisi Maricic, l'organisateur de la première conférence (38) réunions sur la diversité du cytochrome P450 (37), avec un accent sur les systèmes microbiens et végétaux, initiée par Hans-Georg Mueller, un collègue de Ruckpaul à Berlin-Buch et des réunions de l'International Society pour l'étude des xénobiotiques, lancée par Bruce Migdaloff lors de discussions avec Fred DiCarlo, John Baer et Ina Snow à la Gordon Conference on Drug Met de 1980 abolisme et lancé l'année suivante. Peut-être étonnamment, suffisamment de nouveaux résultats sont obtenus des laboratoires du monde entier pour justifier toutes ces réunions et d'autres réunions connexes sur une base régulière. J'ai eu le plaisir de présider les comités qui ont supervisé les symposiums sur les microsomes et les oxydations de médicaments et les conférences P450 pendant de nombreuses années. Sans aucun doute, les collaborations et les amitiés qui sont nées de ces réunions internationales ont été un stimulant majeur pour le développement rapide de ce vaste domaine, y compris son application à la conception et au développement de médicaments.


    BASE DE DONNÉES

    Le site Web SuperCYP a été développé comme une plate-forme conviviale pour les chercheurs et les professionnels de la santé. La barre de navigation sur le côté gauche propose des « FAQ » ou des questions fréquemment posées, pour les utilisateurs novices.

    La « recherche de médicaments » permet à l'utilisateur de rechercher un médicament et de trouver des informations sur son métabolisme. « Obtenir des informations » mène à un tableau répertoriant les CYP impliqués dans le métabolisme du médicament. Ici, il y a aussi une description des conséquences possibles et après avoir cliqué sur le nom du médicament sur la page de résultats « Recherche de médicaments » permet à l'utilisateur d'obtenir des informations sur les composés au moyen du numéro CAS ou du nom.

    L'arbre ATC est le système de classification de l'OMS qui classe les médicaments en différents groupes en fonction de leur site d'action anatomique, de leur effet thérapeutique et de leur structure chimique. C'est la base des recommandations de médicaments alternatifs. Dans une applet Java, l'utilisateur trouve une arborescence déroulante avec des branches de classification majeures et mineures. Tous les médicaments affiliés à une branche mineure sont répertoriés dans un tableau et des informations sur le métabolisme du CYP sont fournies.

    « Interaction médicamenteuse » est la principale caractéristique de la base de données. Il permet aux utilisateurs d'entrer les noms de plusieurs médicaments différents et de vérifier les interactions entre ces médicaments, mais ils reçoivent également des options de médicaments alternatifs.

    À titre d'exemple, l'oméprazole, un inhibiteur de la pompe à protons, et le nébivolol, un bêta-bloquant, interagissent au niveau du CYP. Après avoir sélectionné les médicaments, la base de données fournit des informations détaillées sur les structures des médicaments et le groupe ATC ainsi que les numéros CAS ( Figure 2).

    Requêtes et résultats de l'interface web SuperCyp expliquant les différentes possibilités de l'option « Interaction médicamenteuse » à l'aide de deux exemples de médicaments : l'Oméprazole et le Nébivolol.

    Requêtes et résultats de l'interface web SuperCyp expliquant les différentes possibilités de l'option « Interaction médicamenteuse » à l'aide de deux exemples de médicaments : l'Oméprazole et le Nébivolol.

    La page « résultats » successive avertit que l'oméprazole a un effet inhibiteur sur le CYP 2D6, alors que le nébivolol est un substrat. Le fond coloré du tableau illustre cette double utilisation de la voie métabolique du CYP. Pour éviter cela et optimiser la composition du médicament, l'oméprazole peut être remplacé par d'autres médicaments du même groupe ATC, par exemple le pantoprazol, obtenant un effet comparable, mais en utilisant une autre voie.

    La proposition de Pantoprazol est dérivée de l'hypothèse qu'il n'interagit pas avec le CYP 2D6. Toutes les données sur les médicaments proposés sont fournies et la référence aux publications connexes est indiquée.

    L'interaction CYP-Drug permet aux utilisateurs de parcourir les substrats, les inducteurs et les inhibiteurs d'un certain CYP (Figure 3).

    Résultats de l'interface Web SuperCyp pour le CYP 2D6 expliquant la fonctionnalité du tableau « Interaction CYP-médicament ».

    Résultats de l'interface Web SuperCyp pour le CYP 2D6 expliquant la fonctionnalité du tableau « Interaction CYP-médicament ».

    Une fois que l'utilisateur a sélectionné un CAP dans le menu des tâches, toutes les relations connues avec les drogues sont répertoriées dans un tableau. Ensuite, les utilisateurs peuvent spécifier la relation et se concentrer sur les substrats, les inducteurs ou les inhibiteurs. Les médicaments respectifs sont donnés dans un tableau et combinés avec des informations supplémentaires sur le médicament particulier et toutes les interactions CYP. Les références sont liées à PubMed et à d'autres sites ou articles scientifiques. Le bouton « Informations sur le médicament » est lié à la base de données SuperDrug ( 27), qui fournit un grand nombre d'informations plus spécifiques sur un médicament particulier.

    Le « polymorphisme » montre des polymorphismes nucléotidiques uniques pour un CYP particulier. Tous les allèles connus (15, 28) sont indiqués et s'il y a une diminution ou une augmentation de l'activité ou de l'expression, cette information est fournie. Les modifications nucléotidiques et leurs effets, ainsi que l'activité enzymatique et le type de dosage sont indiqués avec les références correspondantes. Certaines entrées de mutation concernent directement le niveau de protéine, auquel cas des informations sur les SNP peuvent être manquantes. Cependant, il est souhaitable d'inclure des données sur les protéines, car elles fournissent des informations précieuses sur les relations structure-fonction.

    Exemple : Pour le CYP11B2, qui code pour l'enzyme aldostérone synthase (P450aldo), aucun SNP n'a été récupéré via des recherches par mot clé. Cependant, notre système d'extraction de texte d'association de mutations/gènes a trouvé 54 mutations de protéines dans 41 résumés PubMed, qui ont ensuite été ajoutés à la base de données. Parmi ceux-ci, la substitution de l'arginine hautement conservée à la position 384 par la proline aurait conduit à une perte complète de la fonction de cette enzyme dans le cadre du déficit en CMO-I, une maladie héréditaire autosomique récessive chez les hommes de race blanche.

    « Alignements » utilise un programme d'alignement basé sur la structure pour faire correspondre la séquence d'acides aminés de tous les CYP. Il est possible de créer un alignement de séquences multiples à partir de n'importe quel nombre de séquences ou de les aligner avec des séquences externes en téléchargeant un fichier ou en saisissant une séquence au format FASTA. Les utilisateurs peuvent également rédiger une sortie pratique avec Jalview.

    Les « structures tridimensionnelles » présentent les structures protéiques des CYP humains. Les structures existantes ont été extraites de l'APB. Les modèles théoriques ont été générés avec Swiss-Model (29) ou construits manuellement. Toutes les structures sont téléchargeables sous forme de fichiers PDB et plus d'informations sur le CAP sont données dans la case sur le côté droit.

    Cliquer sur le bouton « Parcourir » mène à une applet Java, où tous les CAP sont répertoriés dans une arborescence déroulante, classés par familles principales et sous-familles. Chaque CAP est visualisable en tant que modèle et des informations supplémentaires sur ses interactions sont fournies.


    Figure 4

    Figure 4. Mode de liaison des ligands aromatiques dans le WT et la variante GcoA dans les structures cristallines et les simulations moléculaires. (A) Structure cristalline du gaïacol lié au site actif de WT GcoA (5NCB). (25) (B) Structure de WT GcoA en complexe avec p-vanilline (5OMR).(25) (C) variante GcoA T296S en complexe avec p-vanilline (6CYM). Est également indiqué la double occupation du résidu sérine en position 296. Mode de liaison de MD pour WT GcoA lié avec guaiacol (D), WT lié avec p-vanilline (E), et T296S lié avec p-vanilline (F). Dans D–F, la position de la chaîne latérale de T296 ou S296 (ainsi que R298) est affichée toutes les 2 ns au cours d'une simulation MD de 240 ns. Les distributions de probabilité de la distance de la liaison hydrogène entre T296 et le groupe propionate d'hème dans le système WT/guaïacol (G), entre T296 et l'hème ou la vanilline dans le système WT/vanilline (H), et entre S296 et l'hème ou la vanilline dans T296S/vanilline système (I) révèlent que T296 dans WT stabilise soit l'hème lorsque le gaïacol est lié (A, D, G) ou le ligand lorsque p-vanilline est liée (B, E, H), tandis que le résidu T296S stabilise à la fois l'hème et p-vanilline (C, F, I).

    In Vivo Mesures en P. putida Démontrer une amélioration du chiffre d'affaires de p-Vanilline par GcoA-T296S


    Laboratoire de tissu conjonctif

    Contrairement à l'épithélium, le tissu conjonctif est peu peuplé de cellules et contient une matrice extracellulaire étendue constituée de fibres protéiques, de glycoprotéines et de protéoglycanes. La fonction de ce type de tissu est de fournir un soutien structurel et mécanique aux autres tissus et de faciliter l'échange de nutriments et de déchets entre la circulation et les autres tissus. Ces tissus ont deux composants principaux, une matrice extracellulaire et une variété de cellules de soutien. Ces deux composants seront au centre de ce laboratoire.

    Le plus souvent, les différents types de tissus conjonctifs sont spécifiés par leur contenu en trois types distincts de fibres extracellulaires : les fibres collagènes, les fibres élastiques et les fibres réticulaires.

    Fibres de collagène

    Les fibres de collagène sont constituées de collagène de type I, II ou III et sont présentes dans tous les types de tissu conjonctif. Le tissu conjonctif collagène est divisé en deux types, en fonction du rapport des fibres de collagène à la substance fondamentale. La substance fondamentale est un gel aqueux de glycoprotéines et de protéoglycanes qui occupe l'espace entre les éléments cellulaires et fibrillaires du tissu conjonctif.

    • Le tissu conjonctif lâche (tissu conjonctif aréolaire) est la forme la plus abondante de tissu conjonctif collagène. Il se présente en petits faisceaux allongés séparés par des régions qui contiennent de la substance fondamentale.
    • Le tissu conjonctif dense est enrichi en fibres de collagène avec peu de substance fondamentale. Si les faisceaux de fibres étroitement entassés sont situés dans une direction, cela est appelé régulier s'il est orienté dans plusieurs directions, il est qualifié d'irrégulier. Un exemple de tissu conjonctif dense régulier est celui des tendons un exemple de tissu conjonctif dense irrégulier est celui du derme.

    Fibres réticulaires

    Les fibres réticulaires sont composées de collagène de type III. Contrairement aux fibres collagènes épaisses et grossières, les fibres réticulaires forment un mince réseau réticulaire. De tels réseaux sont répandus parmi différents tissus et forment des structures de soutien dans le foie, les organes lymphoïdes, l'endothélium capillaire et les fibres musculaires.

    Fibres élastiques

    Les fibres élastiques contiennent la protéine élastine, qui copolymérise avec la protéine fibrilline. Ces fibres sont souvent organisées en feuillets lamellaires, comme dans les parois des artères. Un tissu dense, régulier et élastique caractérise les ligaments. Les fibres élastiques sont extensibles car elles sont normalement désorganisées - l'étirement de ces fibres leur donne une structure organisée.

    Cellules du tissu conjonctif

    Fibroblaste

    Les fibroblastes sont de loin le type de cellules natives le plus courant du tissu conjonctif. Le fibroblaste synthétise le collagène et la substance fondamentale de la matrice extracellulaire. Ces cellules fabriquent une grande quantité de protéines qu'elles sécrètent pour construire la couche de tissu conjonctif. Certains fibroblastes ont une fonction contractile, on les appelle myofibroblastes.

    Macrophage

    Le macrophage est le tissu conjonctif représentatif du système réticulo-endothélial ou phagocyte mononucléaire. Ce système se compose d'un certain nombre de cellules phagocytaires mobiles, spécifiques aux tissus, qui descendent des monocytes - il s'agit notamment des cellules de Kupffer du foie, des macrophages alvéolaires du poumon, de la microglie du système nerveux central et des cellules réticulaires du rate. Vous rencontrerez chacun d'eux plus tard dans le cours pour le moment, assurez-vous de reconnaître qu'ils descendent tous des monocytes et que le macrophage est la version du tissu conjonctif. Les macrophages sont indiscernables des fibroblastes, mais peuvent être reconnus lorsqu'ils intériorisent de grandes quantités de substances traceuses visibles comme des colorants ou des particules de carbone. Les macrophages phagocytent les matières étrangères dans la couche de tissu conjonctif et jouent également un rôle important en tant que cellules présentatrices d'antigènes, une fonction que vous apprendrez davantage en immunobiologie.

    Mastocytes

    Les mastocytes sont des cellules granulées que l'on trouve généralement dans le tissu conjonctif. Ces cellules médient les réponses immunitaires aux particules étrangères. En particulier, ils libèrent de grandes quantités d'histamine et d'enzymes en réponse à la reconnaissance de l'antigène. Ce processus de dégranulation est protecteur lorsque des organismes étrangers envahissent l'organisme, mais est également à l'origine de nombreuses réactions allergiques.

    Cellule graisseuse blanche

    Les cellules graisseuses blanches ou adipocytes sont spécialisés pour le stockage des triglycérides et se produisent seuls ou en petits groupes dispersés dans le tissu conjonctif lâche. Ils sont particulièrement fréquents le long des petits vaisseaux sanguins. Lorsque les cellules graisseuses se sont accumulées en abondance au point d'évincer ou de remplacer les éléments cellulaires et fibreux, l'accumulation est appelée tissu adipeux. Ces cellules peuvent atteindre jusqu'à 100 microns et contiennent généralement une vacuole lipidique située au centre - le cytoplasme forme un anneau circulaire autour de cette vacuole, et le noyau est comprimé et déplacé sur le côté. La fonction de la graisse blanche est de servir de source d'énergie et d'isolant thermique.

    Cellule graisseuse brune

    Les cellules graisseuses brunes sont hautement spécialisées dans la régulation de la température. Ces cellules sont abondantes chez les nouveau-nés et les mammifères hibernants, mais sont rares chez les adultes. Ils ont de nombreuses gouttelettes lipidiques plus petites et un grand nombre de mitochondries, dont les cytochromes donnent la couleur brune du tissu. La chaîne de transport d'électrons de ces mitochondries est perturbée par une protéine de découplage, ce qui provoque la dissipation du gradient d'ions hydrogène mitochondrial sans production d'ATP. Cela génère de la chaleur.

    Cartilage

    Le cartilage est une forme spécialisée de tissu conjonctif produit par des cellules différenciées ressemblant à des fibroblastes appelées chondrocytes. Il se caractérise par une matrice extracellulaire proéminente constituée de diverses proportions de fibres de tissu conjonctif intégrées dans une matrice semblable à un gel. Les chondrocytes sont localisés dans les lacunes de la matrice qu'ils ont construite autour d'eux. Les lacunes individuelles peuvent contenir plusieurs cellules dérivées d'un géniteur commun. Les lacunes sont séparées les unes des autres en raison de l'activité sécrétoire des chondrocytes. Trois sortes de cartilage sont classées selon l'abondance de certaines fibres et les caractéristiques de leur matrice.

    Cartilage hyalin

    Le cartilage hyalin a une matrice composée de collagène de type II et de chondromucoprotéine, un copolymère de sulfates de chondroïtine A et C avec une protéine. Sa forte concentration de groupes sulfate chargés négativement le fait apparaître intensément basophile sous H&E. Ce cartilage se trouve dans le nez, les anneaux trachéaux et là où les côtes rejoignent le sternum.

    Fibrocartilage

    Le fibrocartilage se distingue par sa teneur élevée et sa disposition ordonnée des fibres de collagène de type I. Il est généralement situé dans les régions où les tendons s'attachent aux os, aux disques intervertébraux et à la symphyse pubienne.

    Cartilage élastique

    Le cartilage élastique se caractérise par la présence de fibres élastiques abondantes et est assez cellulaire. Il est constitué de collagène de type II et se situe dans l'oreillette de l'oreille et l'épiglotte.


    Introduction

    Le dendroctone du pin ponderosa (MPB Dendroctonus ponderosae) est un ravageur forestier qui attaque les forêts de pins de l'ouest de l'Amérique du Nord [1]. Dans le cadre de son cycle de vie, qui se passe majoritairement dans le phloème de ses divers pins (Pinus) hôtes, le MPB est exposé aux défenses oléorésines de l'arbre. L'oléorésine est principalement composée de monoterpènes et d'acides résiniques diterpéniques (DRA) [2]. La relation entre le MPB et les terpénoïdes hôtes a été largement étudiée, car ces composés ont des rôles chimio-écologiques non seulement en tant que produits chimiques de défense, mais aussi en tant que molécules de signal volatiles par lesquelles le MPB identifie des hôtes appropriés et en tant que précurseurs de phéromone MPB [3]. Alors que certains monoterpènes sont toxiques pour le MPB [4], le MPB et ses associés microbiens peuvent détoxifier certains des métabolites de l'oléorésine [5–10]. Les champignons associés au MPB peuvent utiliser certains des terpènes d'oléorésine, en particulier (+)-(4R)-limonène, comme source de carbone [7]. Le MPB femelle produit la phéromone d'agrégation trans-verbénol du monoterpène hôte α-pinène, qui est abondant dans l'oléorésine de pin [11–13].

    Le génome du MPB contient 86 gènes différents du cytochrome P450 [14], et il a déjà été démontré que trois de ces P450 fonctionnaient dans le métabolisme des terpénoïdes ou la biosynthèse des phéromones terpénoïdes dans le MPB [13,15,16]. Au moins sept MPB P450 différents sont exprimés de manière différentielle dans les organes ou les tissus où le métabolisme des monoterpènes et des DRA est susceptible de se produire, en particulier dans les antennes pour l'olfaction, ainsi que dans le tube digestif et le corps adipeux pour la détoxification et la formation de phéromones [13,17, 18]. Parmi ces sept P450, le CYP345E2 métabolise les monoterpènes (+)-3-carène, (–)-camphène et les deux énantiomères de α-pinène, β-pinène et limonène [15], et le CYP6DE1 oxyde le (+)-3-carène, et les deux énantiomères de α-pinène, β-pinène et converti (–)-α-pinène en (–)-trans-verbenol, une phéromone d'agrégation libérée par le MPB femelle [13]. Parmi ce même ensemble de sept gènes, les transcrits de CYP6DJ1 et CYP6BW3 étaient très abondants dans les antennes, tandis que CYP6BW1 était très abondant dans l'intestin moyen [17]. CYP6BW1 et CYP6BW3 partagent 96% d'identité d'acides aminés, suggérant qu'ils proviennent d'une duplication de gène. Leur expression dans différents tissus indique des fonctions biologiques divergentes. L'analyse de l'abondance des transcrits chez les mâles et les femelles MPB à différents stades de la vie, en particulier les larves de 3e stade larvaire, les pupes et les adultes ténéraux, émergents et colonisateurs a également révélé des différences spécifiques au sexe dans l'expression de ces P450 [17]. Transcription abondance de CYP6DJ1 était significativement plus élevée chez les femelles colonisatrices que chez les mâles colonisateurs, tandis que l'abondance des transcrits de CYP6BW3 était plus élevé chez les mâles colonisateurs. Le CYP6BW1 n'a pas montré de différences d'expression spécifiques au sexe.

    Ici, nous avons étudié les fonctions biochimiques des CYP6DJ1, CYP6BW1 et CYP6BW3 en testant chacun des trois P450 exprimés de manière hétérologue dans une série de in vitro dosages avec dix monoterpènes différents et six DRA comme substrats. Les substrats ont été sélectionnés pour inclure les principaux composés d'oléorésine des hôtes MPB courants. Nous avons comparé les produits d'oxydation des monoterpènes du P450 in vitro dosages avec des produits formés in vivo par les femelles MPB qui ont été exposées aux monoterpènes.


    Méthodes

    Référence H. armigera données et assemblages du génome

    L'ADN a été extrait de la progéniture d'une seule paire de la colonie de laboratoire GR de H. armigera maintenu à Canberra. La colonie provient de collections dans les années 1980 dans les champs de coton de la vallée de Namoi en Nouvelle-Galles du Sud, en Australie, et a été maintenue depuis lors avec un régime alimentaire de laboratoire approprié.L'extraction de l'ADN a été réalisée à partir de pupes entières à un stade avancé en utilisant un protocole standard de phénol et de chloroforme.

    La construction et le séquençage de la bibliothèque ont été réalisés au Baylor College of Medicine, Human Genome Sequencing Center (BCM HGSC), Houston, TX, USA. Plusieurs types différents de bibliothèques de séquençage ont été générés - quelques-uns pour la plate-forme de séquençage 454 mais la plupart pour la plate-forme Illumina. Les données brutes ont été prétraitées pour supprimer les lectures et les bases de mauvaise qualité.

    Un assemblage AllpathsLG [91] des données Illumina (à partir d'une bibliothèque de 180 pb (PE) et de bibliothèques de paires mate (MP) de 3 kb, 6 kb et 8 kb) et d'une bibliothèque MP 454 de 20 kb produite un échafaudage N50 de 1 Mo. Cet assemblage, appelé csiro4b, a constitué la base du gel final du génome, comme décrit dans le fichier supplémentaire 4 : section 13. D'autres assemblages AllpathsLG ont utilisé différentes combinaisons et sous-ensembles des données disponibles en entrée (fichier supplémentaire 4 : tableau S26). Un assemblage Celera Assembler with the Best Overlap Graph (CABOG) [92] de contigs a également été réalisé à l'aide de données sélectionnées 454 et Illumina. Ces autres assemblages ont été utilisés dans la confirmation ou la réparation de modèles de gènes au cours du processus d'annotation décrit ci-dessous. L'assemblage csiro4b a ensuite été corrigé à 100 emplacements avec des séquences identifiées comme donnant des modèles de gènes corrects à partir des autres assemblages ou des données de transcriptome, pour générer le gel du génome patché csiro4bp. De plus amples détails sur la colonie GR, les données de séquençage et les méthodes d'assemblage sont fournis dans le fichier supplémentaire 4 : Section 13.

    H. armigera transcriptomique

    Le matériel de la colonie GR a également été utilisé dans les deux principales expériences de transcriptomique, soit des organismes entiers, soit des tissus disséqués pour l'atlas des transcriptomes tissulaires/développementaux (voir le fichier supplémentaire 4 : tableau S8) et des larves entières du quatrième stade pour l'expérience étudiant les effets du régime alimentaire. (voir ci-dessous). L'ARN total de tous les échantillons a été extrait en broyant le matériel dans une solution « RLT », et l'ARN de l'équivalent de 30 mg de tissu de chaque échantillon a ensuite été purifié à l'aide d'un mini kit RNeasy (Qiagen, Victoria, Australie). L'ARN a été élué dans l'eau, avec un rendement minimum de 40 g. La qualité et la quantité d'ARN dans une aliquote de chaque échantillon ont été déterminées par électrophorèse sur un système de puce Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) et par absorption UV sur un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA , ETATS-UNIS). L'ARN restant de chaque échantillon a été précipité avec de l'éthanol et de l'acétate de sodium et conservé à -80 °C. La construction de la bibliothèque et le séquençage de l'ARN ont été effectués au BCM HGSC.

    Un premier assemblage de transcriptome complet utilisant toutes les lectures d'ARN-seq de ces deux expériences de transcriptomique a été généré à l'aide de TopHat et de Cufflinks [93, 94]. Un deuxième assemblage, après rognage des lectures PE (100 b) à 80 b à l'aide du FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit), a ensuite été généré à l'aide de Trinity [95], comme décrit en détail dans Kanost et al. [40].

    Les microARN ont été séquencés à partir de l'ARN total récolté des larves du premier stade, des mésogastres des larves du quatrième stade et des pupes, encore une fois tous de la colonie GR. Après extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol, l'ARN total a été remis en suspension dans de l'eau MQ traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC), quantifié avec un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 et contrôlé dans un bioanalyseur Agilent 2100. Environ 100 ng d'ARN total ont été dénaturés à 70 °C pendant 1 min, suivis d'un refroidissement sur glace et d'un séquençage Illumina (Geneworks, Adelaide, Australie).

    Annotation de la H. armigera génome

    Cette étape impliquait une annotation automatisée avec MAKER et Program to Assemble Spliced ​​Alignments (PASA2). La première étape de notre annotation automatisée de csiro4b impliquait le pipeline MAKER [96]. Les outils de prédiction de gènes ab initio Augustus [97], Semi-HMM-based Nucleic Acid Parser (SNAP) [98] et GeneMark [99] incorporés dans MAKER ont été entraînés à l'aide d'un ensemble de gènes sélectionnés manuellement (voir ci-dessous). Comme détaillé dans le fichier supplémentaire 4 : section 13, le processus a ensuite été répété plusieurs fois avec l'inclusion des assemblages ARN-seq et des bases de données de preuves supplémentaires constituées d'ensembles de gènes prédits à partir d'autres génomes d'insectes. Une méthode personnalisée utilisant les pipelines OrthoMCL [100] et CD-HIT [101] a ensuite été utilisée pour évaluer la qualité des gènes prédits de chacune des neuf analyses MAKER et pour consolider les gènes des différentes analyses MAKER dans un ensemble consensuel ( Dossier complémentaire 4 : article 13). Les neuf essais MAKER et l'approche OrthoMCL + CD-HIT ont produit ensemble 18 636 protéines distinctes.

    De nombreux modèles de protéines produits par MAKER résultent de fusions de gènes dupliqués adjacents. Cependant, ces problèmes ont été résolus dans une ré-annotation complète en utilisant JAMg (http://jamg.sourceforge.net) selon Papanicolaou et al. [102]. En bref, le MAKER, la preuve du domaine protéique, Kassiopeia [103], GeneMark, la couverture RNA-seq, les lectures d'ADNc couvrant les introns et les gènes précédemment sélectionnés manuellement ont été fournis comme preuves avec un poids respectivement croissant pour le prédicteur du gène Augustus de novo. Cette sortie multicouche a ensuite été réconciliée à l'aide d'EVidenceModeler [104] et annotée pour les régions non traduites (UTR) et la transcription alternative à l'aide des données RNA-seq et PASA2 [104, 105], donnant 22 818 modèles de transcription. Un ensemble unigène de référence (c. Enfin, 1088 modèles de gènes annotés manuellement pour des familles de gènes spécifiques (voir ci-dessous) ont remplacé les modèles de gènes automatisés correspondants, donnant OGS2. Scipio [106] a été utilisé pour dériver les coordonnées de localisation du génome pour les modèles de gènes annotés manuellement.

    Annotation fonctionnelle de modèles de gènes dans des familles clés

    Les modèles de gènes générés automatiquement pour les familles de gènes clés de détoxification, de digestion et de chimiosensorialité ont été recoupés et sélectionnés manuellement à l'aide de toutes les séquences, ADNc et modèles de gènes disponibles. Pour les familles de détoxification et de digestion, cela comprenait l'utilisation d'un pipeline de recherche et d'alignement de gènes spécialement développé (Fichier supplémentaire 4 : Section 13) où les modèles générés différaient de ceux des assemblages finaux, ces derniers ont ensuite été corrigés de manière appropriée. D'autres familles répertoriées dans le tableau complet d'annotation des familles (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2) ont été annotées sur la base de l'utilisation de scripts perl personnalisés pour identifier les protéines avec des motifs spécifiques (par exemple, les protéines cuticulaires) ou par le criblage semi-automatisé de Basic Local. Annotations dérivées de l'outil de recherche d'alignement (BLAST).

    Annotations fonctionnelles du génome entier

    Les séquences de protéines OGS2 ont été analysées à l'aide d'une version personnalisée du pipeline InterProScan [107], y compris les annotations GO [108], Pfam [109], PROSITE [110] et Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) [111]. Les protéines portant des domaines pertinents identifiés par ces analyses ont été signalées pour confirmation en tant que membres de familles de gènes spécifiques. Les affectations de termes GO ont été largement utilisées dans les pipelines personnalisés construits sur la base de données GO et dans le plugin Biological Networks Gene Ontology (BiNGO) [112] pour Cytoscape [113]. Pour analyser l'enrichissement fonctionnel dans des ensembles de gènes spécifiques, les termes GO ont été résumés par filtrage de similarité sémantique et visualisés à l'aide de REVIGO [114].

    Répétitions et microARN

    Les séquences répétées dans le génome ont été identifiées à l'aide de RepeatModeler [115]. Toutes les répétitions de lépidoptères précédemment identifiées ont d'abord été obtenues à partir de RepBase et utilisées pour interroger le H. armigera génome. Ces répétitions ont ensuite été utilisées comme bibliothèques de répétitions connues pour 10 itérations d'exécutions de RepeatModeler à l'aide de RepeatScout et de rmblast. Les répétitions récupérées ont ensuite été masquées dans le H. armigera génome à l'aide de RepeatMasker. Les données de séquence d'ARN pour l'analyse des miARN ont d'abord été traitées à l'aide de scripts perl personnalisés, puis les miARN ont été prédits à l'aide de miRDeep2 [116]. Une analyse plus poussée contre les miARN connus d'autres insectes a été entreprise à l'aide de miRBase19 [117].

    Référence H. zea assemblages et annotations du génome et du transcriptome

    Séquençage du génome pour H. zea utilisé de l'ADN extrait de pupes d'une colonie de laboratoire établie avant l'introduction de cultures transgéniques Bt et maintenue sans infusion d'insectes sauvages pendant au moins 25 ans [118]. Cette colonie de laboratoire était très sensible à toutes les toxines Bt par rapport aux animaux sauvages H. zea [118,119,120]. Des mâles et des femelles vierges ont été utilisés pour la consanguinité des insectes au cours de trois générations d'accouplements en un seul couple. Des pupes mâles de la génération finale ont été utilisées pour obtenir un ADN génomique de haut poids moléculaire pour la préparation de bibliothèques de séquençage Illumina. Les bibliothèques ont été construites et séquencées comme pour H. armigera dessus.

    Un assemblage AllpathsLG des données Illumina a produit un N50 de 196 kb (Hz-csiro5 dans le fichier supplémentaire 4 : Tableau S27). Encore une fois, une série d'autres assemblages AllpathsLG ont utilisé différentes combinaisons et sous-ensembles des données d'entrée répertoriées dans le fichier supplémentaire 4 : tableau S27. Correction et patching du Hz-csiro5 pour produire le final H. zea le gel du génome (hz5p5) est décrit dans le fichier supplémentaire 4 : Section 13, ainsi que de plus amples détails sur le H. zea colonie et les données de séquençage et les méthodes d'assemblage utilisées.

    Les données du transcriptome utilisées dans l'annotation de la H. zea génome comprenait un assemblage préliminaire de 454 et de données Illumina RNA-seq. Les 454 données ont été obtenues à partir d'un pool d'ARN commençant par des embryons de 24 à 48 h, tous les stades larvaires, des pupes et des mâles et femelles adultes. Les données Illumina RNA-seq provenaient d'embryons de 24 à 48 h et de larves de troisième stade. Les larves ont été traitées avec des doses sublétales de Cry1Ac, de novaluron, de cyperméthrine et d'Orthène pour induire des gènes impliqués dans la dégradation xénobiotique qui peuvent normalement ne pas être exprimés. Les 454 bibliothèques ont été normalisées. Les données de séquence d'ARN ont été assemblées avec Trinity (version trinityrnaseq_r20140413p1) en utilisant des méthodes d'assemblage guidées par le génome et de novo comme ci-dessus pour H. armigera.

    Les H. zea les génomes ont été criblés à l'aide de H. armigera séquences protéiques du modèle de gène OGS2 et Scipio [106] pour identifier les meilleurs modèles de gènes possibles pour H. zea. Voir le fichier supplémentaire 4 : section 13 pour plus de détails.

    Orthologie et analyses évolutives des familles de gènes cibles

    Modèles de gènes pour les familles de gènes liés à la détoxification et à la digestion dans H. armigera et H. zea ont été obtenus comme décrit ci-dessus. Pour les autres espèces analysées dans le tableau 2, les modèles de gènes générés automatiquement et les ensembles de gènes officiels ont été recoupés et sélectionnés manuellement par des spécialistes du domaine à l'aide des séquences, des ADNc et des modèles de gènes disponibles générés par le pipeline dédié basé sur EXONERATE. Annotations actuelles de B. mori et M. sexta les membres de ces familles ont été recoupés et, dans certains cas, révisés par une procédure similaire, bien que dans ce cas, les quelques modèles qui différaient de ceux de l'assemblage du génome n'aient pas été patchés dans cet assemblage. Tous nos modèles de gènes finaux pour ces familles pour les trois espèces sont résumés dans le fichier supplémentaire 6 : tableau S5. D'autres familles d'intérêt dont les modèles de gènes sont répertoriés dans ce tableau ont été identifiées et annotées soit à l'aide de scripts perl personnalisés pour cribler les protéines avec des motifs spécifiques (par exemple, les protéines cuticulaires), soit par criblage semi-automatique des annotations dérivées de BLAST.

    Les méthodes phylogénétiques utilisées pour analyser les processus évolutifs opérant dans la plupart des familles de gènes étaient telles que décrites dans les méthodes pour les figures supplémentaires 19-21 de Kanost et al. [40]. En bref, nous avons utilisé un logiciel d'alignement de séquences multiples (MAFFT) [121] avec l'option linsi pour effectuer un alignement de séquences multiples, que nous avons ensuite masqué pour les sites avec plus de 50 % de lacunes ou de caractères ambigus. Des analyses phylogénétiques ont ensuite été réalisées en utilisant IQ-TREE [122], qui implémente une méthode de bootstrap ultrarapide [123] et ModelFinder, une nouvelle méthode de sélection de modèles qui améliore considérablement la précision des estimations phylogénétiques [124]. Après avoir trouvé le modèle optimal pour chaque famille, nous avons ensuite déduit l'arbre le plus probable à l'aide de IQ-TREE, avec des scores de bootstrap déduits à l'aide de la méthode de bootstrap ultrarapide. Deux autres méthodes phylogénétiques ont été utilisées pour quelques ensembles de données. PhyML [125] a été utilisé pour certains ensembles de données plus petits, et pour l'ensemble de données GR de qualité inférieure, le Randomized Axelerated Maximum Likelihood (RAxML) [126] a été utilisé. Les arbres ont été illustrés à l'aide du package R ggtree [127].

    Les analyses de datation de divergence parmi des sous-ensembles de familles de gènes au sein ou entre différentes espèces ou lignées ont utilisé la méthode bayésienne MCMC dans BEAST v2.4.3 [55]. Les séquences protéiques alignées à l'aide de MAFFT comme décrit ci-dessus pour les analyses phylogénétiques ont été utilisées pour informer le coalignement des séquences nucléotidiques à l'aide d'un script perl personnalisé. Si nécessaire, les modèles de site ont été dissociés pour permettre différents taux d'évolution à chaque locus (comme déterminé dans IQ-TREE ci-dessus), mais les modèles d'horloge et d'arbre ont été liés afin qu'ils ne varient pas entre les partitions de locus. Un fichier d'entrée XML a ensuite été généré pour BEAST v2.4.3 à l'aide de BEAUti v2.4.3. Le prieur de t MRCA (temps jusqu'à l'ancêtre commun le plus récent) et la hauteur des racines ont été fixées à une distribution lognormale, avec une moyenne de ln (1,5) et un écart type de 0,01. Une horloge moléculaire stricte avec une distribution uniforme a été appliquée en utilisant le taux de mutation déterminé pour H. melpomène de 2,9 × 10 –9 (intervalle de confiance à 95 %, 1,3 × 10 −9 à 5,5 × 10 −9 ) substitutions par site et par génération [128]. Un temps de génération de 0,25 an correspondant au milieu de gamme défini par Fitt [67] pour les régions subtropicales et tempérées a été utilisé pour certaines analyses. Les arbres ont été annotés dans TreeAnnotator v2.4.3 [129] et visualisés dans FigTree v1.4.2 [130].

    Tests de taux relatifs de H. armigera les gènes ont utilisé les paralogues les plus proches indiqués dans les arbres phylogénétiques pour chaque famille dans le fichier supplémentaire 4 : sections 1–8. Les séquences protéiques alignées à l'aide de MAFFT comme décrit ci-dessus pour les analyses phylogénétiques ont été utilisées pour informer le coalignement des séquences nucléotidiques à l'aide d'un script perl personnalisé. Les tests de vitesse relative de Tajima [131] ont été effectués dans le logiciel d'analyse génétique évolutive moléculaire (MEGA) [132].

    Atlas transcriptomique tissulaire/développemental

    Trente et un échantillons de GR élevés avec un régime standard ont été collectés pour cette analyse, quatre provenant d'organismes entiers de stades de vie spécifiques et 27 de tissus ou de parties du corps de larves ou d'adultes au cinquième stade. Les détails des échantillons sont donnés dans le fichier supplémentaire 4 : tableau S8. La préparation et le séquençage de l'ARN et de la banque étaient tels que décrits ci-dessus.

    Expérience de transcriptomique de régime

    Les modèles d'expression des gènes ont été comparés entre les larves élevées sur différentes plantes hôtes. Les plantes ont été sélectionnées pour maximiser la diversité des réponses pouvant être observées [64]. L'ensemble comprenait un monocotylédone, du maïs, Zea mays (banques d'ARN larvaires M-3, GenBank BioSamples 6608687-9) et des plantes de quatre familles de plantes dicotylédones : Malvaceae, coton, Gossypium hirsutum (banques d'ARN larvaires Ct1-3, GenBank BioSamples 6608702-4) Brassicacées, cresson de thale, Arabidopsis thaliana (banques d'ARN larvaires AR1-3, GenBank BioSamples 6608666-8) Fabaceae, haricot vert, Phaseolus vulgaris (banques d'ARN larvaires GB1-3, GenBank BioSamples 6608675-7) et Solanaceae, tabac, Nicotiana tabacum (banques d'ARN larvaires Tb1-3, GenBank BioSamples 6608696-8), tomate, Lycopersicon esculentum (banques d'ARN larvaires TM1-3, GenBank BioSamples 6608699-701) et piment, Capsicum frutescens (banques d'ARN larvaire Hp1-3, GenBank BioSamples 6608678-80). Pour référence, les larves ont également été élevées avec un régime alimentaire standard de laboratoire [133, 134] (banques d'ARN larvaires Sd1-3, GenBank BioSamples 6608693-5).

    Environ 10 larves de la colonie GR ont été transférées aux plantes ou à l'alimentation du laboratoire en triple dans les 24 heures suivant l'éclosion et sans exposition à aucune alimentation antérieure. Chaque réplique consistait en un pot contenant soit une seule plante pour les espèces plus grandes, soit plusieurs plantes pour les espèces plus petites. Les larves ont été transférées aux plantes lorsque les fleurs avaient commencé à se former mais avant qu'aucun fruit ne soit présent. Les plantes ont été cultivées dans les mêmes conditions de serre et chacun des trois réplicats a utilisé des larves d'une cohorte différente de la culture en laboratoire. Comme l'ont souligné d'autres [64, 135], les larves élevées avec un régime artificiel avant une telle expérience de réponse de l'hôte sont considérées comme offrant l'avantage de ne pas être amorcées pour une plante hôte particulière.

    Afin de récolter toutes les larves à un stade de développement comparable quelle que soit la plante hôte, six larves de chaque réplicat ont été collectées sur les plantes lorsqu'elles sont revenues se nourrir un jour après la mue au quatrième stade. Le temps mis pour atteindre ce stade a été noté, et les larves ont été pesées elles ont ensuite été immédiatement coupées avec des ciseaux à dissection en trois ou quatre morceaux. Leur ARN a été préservé en déposant immédiatement les morceaux dans une solution de RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA), qui a été initialement maintenue sur de la glace pour permettre à la solution de diffuser dans les tissus, puis congelée à -80 °C.

    L'ARN total a été préparé à partir des six larves comprenant chaque réplicat selon les méthodes décrites ci-dessus, sauf que les bibliothèques pour le séquençage ont été réalisées au United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service (USDA-ARS, Stoneville, MS, USA). Le séquençage de l'ARN a été effectué au BCM HGSC comme ci-dessus.

    Il n'a pas été possible d'entreprendre des expériences transcriptomiques de régime parallèles sur H. zea dans cette étude, car il n'est pas trouvé en Australie et donc soumis à des interdictions strictes de quarantaine de biosécurité. Une telle étude de suivi devrait donc être entreprise dans un pays connu pour abriter les deux espèces.

    Analyses de transcriptome

    Les lectures de séquençage ont été nettoyées à l'aide de Trimmomatic [136] pour supprimer la séquence de l'adaptateur et les lectures de mauvaise qualité. Les lectures de passage ont été alignées sur le H. armigera Assemblage csiro4bp avec l'aligneur subread implémenté dans le package Rsubread [137]. Un maximum de trois discordances a été autorisé dans l'alignement, et le meilleur alignement de notation pour chaque lecture a été signalé. Les nombres de lectures par bibliothèque qui se chevauchaient avec les transcrits prédits décrits ci-dessus ont été résumés au niveau du gène avec featureCounts [138]. Pour être pris en compte pour une analyse plus approfondie, un niveau minimum de cinq lectures par million dans trois bibliothèques était requis. Dans le cas de l'atlas du développement/tissu, un critère d'inclusion alternatif d'au moins 20 lectures par million dans au moins une bibliothèque a été autorisé pour capturer des gènes qui peuvent avoir été exprimés dans un seul stade de la vie ou un seul tissu échantillonné. Ces critères ont donné lieu à 13 099 et 11 213 gènes considérés comme exprimés dans l'atlas du développement/des tissus et l'analyse de l'utilisation de l'hôte, respectivement, avec un total de 13 689 gènes uniques dans les deux ensembles de données.

    Les comptes de lecture ont été normalisés entre les échantillons en utilisant la moyenne tronquée de M-values ​​[139] et convertis en log2 comptes par million de valeurs (log2cpm) avec les poids de qualité associés à l'aide du pipeline voom-limma [140]. Pour l'expérience d'utilisation de l'hôte, l'expression des gènes a été modélisée simplement comme un facteur du régime alimentaire sur lequel les larves ont été élevées. Pour supprimer les effets de la variation indésirable due aux variables latentes non corrélées avec le régime larvaire, trois variables de substitution [141, 142] ont été estimées à partir des données et incluses dans le modèle d'expression. Gènes avec une différence d'expression significative par rapport au régime témoin (taux de fausse découverte ajusté p une valeur inférieure à 0,05) et un changement d'expression d'un facteur log2 supérieur à 1,5 ont été considérés comme sensibles au régime alimentaire.

    Pour une analyse plus large de l'expression des gènes, nous avons construit des réseaux de co-expression de gènes à partir de nos données d'expression pour identifier des ensembles de gènes qui présentent des profils d'expression corrélés. Des critères de filtrage supplémentaires ont été utilisés pour garantir que seuls les gènes qui présentaient un certain niveau de variation d'expression étaient pris en compte dans la construction du réseau. Les critères d'inclusion étaient que la valeur d'expression moyenne de log2cpm devait être supérieure à 1 et que l'écart type de la valeur devait être supérieur à 0,5. Semblable à l'étape de filtrage précédente, un critère d'acceptation supplémentaire a été inclus pour l'ensemble de données sur les tissus afin de permettre l'inclusion de gènes exprimés dans un petit nombre de bibliothèques. Le critère supplémentaire pour cet ensemble de données était que tout gène avec un écart type supérieur à 2 était inclus. Des réseaux de corrélation pondérés non signés ont été produits à partir des ensembles de données sur le régime alimentaire et les tissus/développement avec l'analyse de réseau de corrélation pondérée du package R (WGCNA) [143]. Le paramètre de puissance utilisé pour chaque réseau était de 11 et 8, respectivement, choisi comme la valeur la plus basse avec un ajustement topologique sans échelle R carré supérieur à 0,85. Les modules d'expression génique ont été déterminés à partir d'une matrice de chevauchement topologique, et les modules avec des modèles d'expression de gènes propres hautement corrélés (>0.85) ont été fusionnés.

    Expériences et analyses de reséquençage

    Trois supplémentaires H. armigera lignes, une d'Afrique et deux de Chine, et quatre autres H. zea des individus, tous originaires des États-Unis, ont été séquencés en tant que base de données pour diverses analyses génomiques de population. L'Africain H. armigera souche, SCD, est originaire de Côte d'Ivoire dans les années 1970 et a été maintenue en laboratoire sans exposition à des insecticides ou à des toxines Bt pendant plus de 130 générations d'accouplement de masse avant la préparation de l'ADN. Une lignée chinoise, SW, a été fondée en 2012 à partir de 150 papillons collectés dans les champs de coton de Shawan dans la région autonome ouïgoure du Xinjiang. SW a été élevé pendant 17 générations d'accouplement en masse en laboratoire sans exposition à des insecticides ou à des toxines Bt avant la préparation de l'ADN. L'autre lignée chinoise, AY, a été créée à partir d'une seule paire de papillons collectés en 2011 à Anyang dans la province du Henan [79]. AY, qui a survécu à la concentration diagnostique de Cry1Ac de 1 g/cm 2 , a été élevé pendant plus de 30 générations avant la préparation de l'ADN. Pour ces lignes SCD, SW et AY de H. armigera, l'ADN a été préparé à partir de pupes mâles individuelles. L'ADN a ensuite été utilisé dans la construction de bibliothèques de 500b PE qui ont été quantifiées et séquencées sur une plate-forme Illumina HiSeq2000 au Beijing Genomics Institute (BGI, Shenzhen, Chine) en utilisant des protocoles internes standard.

    Les quatre H. zea des individus avaient été collectés sous forme de larves sur des plantes hôtes sauvages dans le comté de Bolivar, Mississippi. L'ADN a été préparé à partir de leur thorax lorsqu'ils sont apparus à l'âge adulte et utilisé pour construire des bibliothèques de séquençage à l'aide d'un kit de construction de bibliothèque Illumina Nextera. Les bibliothèques d'ADN génomique ont été fractionnées par taille sur un instrument Pippin Prep (Sage Science Inc., Beverly, MA, USA) pour obtenir des fragments de 550 ± 20 b (taille de l'encart 400-450 b) et quantifiées à l'aide d'un kit de quantification de bibliothèque KAPA (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, États-Unis). Un pool équimolaire des quatre bibliothèques a été séquencé sur un instrument Illumina HiSeq2500 à l'unité de recherche en génomique et bioinformatique de l'USDA-ARS, Stoneville, MS, États-Unis.

    Les lectures de séquence de chaque ligne ou individu ont été corrigées en utilisant Blue [144] et alignées sur le H. armigera génome de référence avec le Genomic Short-read Nucleotide Alignment Program (GSNAP) [145]. Pour s'assurer que le choix du génome de référence n'influence pas nos résultats, les alignements réciproques de toutes les lignées ou individus contre le H. zea génome de référence ont également été réalisées. À l'aide de la boîte à outils d'analyse du génome (GATK) [146], nous avons appliqué la suppression des doublons et le réalignement local autour des indels, suivis d'un génotypage SNP à l'aide de paramètres de filtrage dur standard conformément aux recommandations des meilleures pratiques GATK [147, 148]. Comme étape supplémentaire pour nous permettre de mieux comparer les séquences des deux espèces, nous avons imposé le critère de filtrage supplémentaire selon lequel un variant doit être génotypé sur toutes les lignées ou individus séquencés pour être inclus dans notre analyse.

    Les relations génétiques entre H. armigera et H. zea ont été examinés à l'aide de fichiers de données MDS sur SNP générés pour toutes les séquences de notre ensemble de données, y compris à la fois le H. armigera et H. zea séquences de référence.

    L'analyse de la coalescence a été réalisée sur 16 loci (voir Fichier supplémentaire 3 : Figure S5 Fichiers supplémentaires 11 et 12), représentant les gènes présents dans tous les H. armigera et H. zea échantillons, y compris les deux séquences de référence, ainsi que dans l'exogroupe H. punctigera (c'est à dire. m = 10 pour chaque locus). L'ensemble de loci sélectionnés pour cette analyse était des orthologues un à un dans tous les échantillons, avec seulement jusqu'à 1% des sites dans un locus donné étant masqués (c'est-à-dire pour une couverture de séquençage <10×) ou hétérozygotes. Ces critères ont abouti à un ensemble de loci bien conservés dans ces 10 échantillons utilisés par la suite dans l'analyse de coalescence dans BEAST v2.4.3 [149]. Tous les loci ont d'abord été alignés indépendamment en utilisant l'option linsi dans MAFFT v7.182 [121]. IQ-TREE v1.4.1 [122] a ensuite été utilisé avec l'option -m TESNEWONLY pour déterminer le modèle de taux d'évolution le mieux adapté pour chaque locus. BEAUti v2.4.3 (modèle StarBeast) a été utilisé pour générer un fichier d'entrée XML BEAST, définissant des modèles de taux individuels pour chaque locus tel qu'identifié dans IQ-TREE et déliant les modèles d'arbre. Un processus de Yule pour la coalescence multi-espèces et une taille de population «linéaire avec racine constante» ont été les paramètres sélectionnés pour générer le fichier d'entrée BEAST. L'analyse a été effectuée pour >100 × 10 6 chaînes MCMC pour atteindre la convergence des probabilités d'arbre et pour obtenir des valeurs de taille d'échantillon effective (ESS) >200 (évaluées dans Tracer v1.6.0 [150]). L'analyse BEAST a produit un arbre d'espèces global pour H. armigera, H. zea et H. punctigera, ainsi que des arbres de gènes individuels pour chaque locus. Ces derniers ont été transmis à DensiTree v2.2.2 [55] pour vérifier si la topologie est cohérente avec l'arbre global des espèces. En cas de conflit entre le gène et les arbres d'espèces, nous avons étudié les loci en question pour évaluer si nous pouvions trouver des preuves d'un tri de lignée incomplet entre H. armigera et H. zeune.

    Les tailles effectives historiques des populations et leurs changements dans le temps ont été estimés pour H. armigera et H. zea en utilisant la méthode bayésienne de tracé d'horizon telle qu'implémentée dans BEAST v1.8.2 [151]. Les ensembles de données utilisés étaient des SNP à l'échelle du génome appelés séparément pour chacun des échantillons suivants : pour H. armigera, séquences des lignes AY, SW et SCD contre les H. armigera génome de référence et pour H. zea, les quatre personnes décrites ci-dessus contre le H. zea génome de référence. Les deux ensembles d'échantillons ont également été appelés contre le génome de l'autre espèce comme contrôle. Les échantillons MCMC étaient basés sur 10 8 générations, enregistrant toutes les 1 000 étapes, les 10 7 premières générations étant rejetées en tant que burn-in. Nous avons utilisé un modèle d'horizon linéaire par morceaux, un modèle de substitution HKY et une horloge stricte avec le taux de substitution moyen déterminé pour H. melpomène de 2,9 × 10 –9 (intervalle de confiance à 95 %, 1,3 × 10 –9 à 5,5 × 10 –9 ) substitutions par site et par génération [128].

    Pour examiner la diversité synonyme et non synonyme entre les deux espèces, nous avons analysé la diversité nucléotidique (pi) dans notre H. armigera et H. zea échantillons (c'est-à-dire en excluant les souches de référence). Nous avons exploré davantage la diversité génomique moyenne en examinant tous les sites polymorphes (c.

    8,2 M de SNP appelés à travers le génome). Les mesures de diversité n'ont compté que les fenêtres où il y avait un minimum de 10 SNP par fenêtre de génome de 10 kb.


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