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Qu'est-ce qui est arrivé en premier ? L'ADN ou les ADN polymérases ?

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Je sais que cela ressemble beaucoup à la question de la poule et de l'œuf et bien que cette dernière ait une réponse, je suis intriguée par la première.

Une forme modifiée de la question serait, au cours de l'abiogenèse, qu'est-ce qui s'est formé en premier ? L'ADN ou les protéines (d'où les enzymes et les ADN polymérases) ?

Le principe sous-jacent est que l'ADN a besoin d'une enzyme pour se répliquer. (DNA pol)

Mais l'ADN pol lui-même, étant une protéine, a besoin d'un gène ADN pol A/B/C sur l'ADN ! (Transcription et traduction) Sans parler de toutes les autres protéines nécessaires à la transcription et à la traduction.

Il en est de même pour l'ARN et l'ARN pol.

Si l'ADN/ARN s'est formé en premier, comment s'est-il répliqué sans protéine ? Si la protéine s'est formée en premier, alors comment a-t-elle vu le jour sans ADN/ARN ?

Faisons une grande hypothèse et disons que l'acide nucléique s'est formé pour la première fois et s'est répliqué sans protéines. Est-il possible que les acides nucléiques se répliquent sans protéines ? Par exemple, une séquence d'ADN formée de manière abiogénétique a juste attiré au hasard son brin complémentaire et tout ce qui pouvait s'adapter, s'est ajusté et d'une manière ou d'une autre, les liaisons phosphodiester ont été scellées sans protéines. Cela semble trop invraisemblable.

J'adorerais que quelqu'un fournisse à des sources des preuves d'ADN/protéine formant abiotiquement de novo sans enzymes, gènes.


La réponse directe est : nous ne savons pas. Nous n'avons aucune preuve directe de ce qui s'est passé à ce moment-là ni aucune théorie complètement développée et cohérente sur la façon dont cela a fonctionné.

L'hypothèse largement répandue est l'hypothèse du "monde de l'ARN". L'ARN, contrairement à l'ADN, est capable de se replier spontanément pour former des molécules catalytiques et évite ainsi les besoins de traduction et de transcription par les protéines puisqu'il peut amorcer sa propre synthèse. L'idée est qu'au fil du temps, l'ARN a développé les moyens de synthétiser des protéines, puis a commencé à utiliser l'ADN comme molécule de stockage plus stable. Les premières ARN polymérases à base d'ARN ont été supplantées par des protéines polymérases plus fidèles au cours de l'évolution, de sorte que nous ne les voyons plus dans les cellules modernes.


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Contenu

En 1956, Arthur Kornberg et ses collègues ont découvert l'ADN polymérase I (Pol I), dans Escherichia coli. Ils ont décrit le processus de réplication de l'ADN par lequel l'ADN polymérase copie la séquence de bases d'un brin d'ADN matrice. Kornberg a ensuite reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959 pour ce travail. [7] L'ADN polymérase II a été découverte par Thomas Kornberg (le fils d'Arthur Kornberg) et Malcolm E. Gefter en 1970 tout en élucidant davantage le rôle de Pol I dans E. coli Réplication de l'ADN. [8] Trois autres ADN polymérases ont été trouvées dans E. coli, y compris l'ADN polymérase III (découvert dans les années 1970) et les ADN polymérases IV et V (découvert en 1999). [9]

La fonction principale de l'ADN polymérase est de synthétiser l'ADN à partir de désoxyribonucléotides, les éléments constitutifs de l'ADN. Les copies d'ADN sont créées par l'appariement de nucléotides à des bases présentes sur chaque brin de la molécule d'ADN d'origine. Cet appariement se produit toujours dans des combinaisons spécifiques, avec la cytosine avec la guanine et la thymine avec l'adénine, formant respectivement deux paires distinctes. En revanche, les ARN polymérases synthétisent de l'ARN à partir de ribonucléotides à partir d'ARN ou d'ADN.

Lors de la synthèse d'un nouvel ADN, l'ADN polymérase peut ajouter des nucléotides libres uniquement à l'extrémité 3' du brin nouvellement formé. Il en résulte un allongement du brin nouvellement formé dans une direction 5'-3'.

Il est important de noter que la directionnalité du brin nouvellement formé (le brin fille) est opposée à la direction dans laquelle l'ADN polymérase se déplace le long du brin matrice. Étant donné que l'ADN polymérase nécessite un groupe 3' OH libre pour l'initiation de la synthèse, elle ne peut synthétiser que dans une seule direction en prolongeant l'extrémité 3' de la chaîne nucléotidique préexistante. Par conséquent, l'ADN polymérase se déplace le long du brin matrice dans une direction 3'-5' et le brin fille se forme dans une direction 5'-3'. Cette différence permet à l'ADN double brin formé d'être composé de deux brins d'ADN qui sont antiparallèles l'un par rapport à l'autre.

La fonction de l'ADN polymérase n'est pas tout à fait parfaite, l'enzyme faisant environ une erreur pour chaque milliard de paires de bases copiées. La correction d'erreur est une propriété de certaines ADN polymérases, mais pas de toutes. Ce processus corrige les erreurs dans l'ADN nouvellement synthétisé. Lorsqu'une paire de bases incorrecte est reconnue, l'ADN polymérase recule d'une paire de bases d'ADN. L'activité exonucléase 3'-5' de l'enzyme permet d'exciser la paire de bases incorrecte (cette activité est connue sous le nom de relecture). Après l'excision de la base, la polymérase peut réinsérer la base correcte et la réplication peut continuer vers l'avant. Cela préserve l'intégrité du brin d'ADN d'origine qui est transmis aux cellules filles.

La fidélité est très importante dans la réplication de l'ADN. Les mésappariements dans l'appariement des bases d'ADN peuvent potentiellement entraîner des protéines dysfonctionnelles et pourraient conduire au cancer. De nombreuses ADN polymérases contiennent un domaine exonucléase, qui agit en détectant les mésappariements de paires de bases et en supprimant le nucléotide incorrect pour être remplacé par le bon. [10] La forme et les interactions accueillant la paire de bases Watson et Crick sont ce qui contribue principalement à la détection ou à l'erreur. Les liaisons hydrogène jouent un rôle clé dans la liaison et l'interaction des paires de bases. On dit que la perte d'une interaction, qui se produit lors d'un mésappariement, déclenche un changement d'équilibre, pour la liaison de la matrice-amorce, de la polymérase, au domaine exonucléase. De plus, l'incorporation d'un mauvais nucléotide provoque un retard dans la polymérisation de l'ADN. Ce délai donne le temps à l'ADN de passer du site de la polymérase au site de l'exonucléase. Différents changements de conformation et perte d'interaction se produisent à différentes discordances. Dans un mésappariement purine:pyrimidine, il y a un déplacement de la pyrimidine vers le grand sillon et de la purine vers le petit sillon. Par rapport à la forme de la poche de liaison de l'ADN polymérase, des conflits stériques se produisent entre la purine et les résidus dans le petit sillon, et d'importantes interactions de van der Waals et électrostatiques sont perdues par la pyrimidine. [11] Les mésappariements pyrimidine:pyrimidine et purine:purine présentent des changements moins notables puisque les bases sont déplacées vers le sillon principal et moins d'encombrement stérique est ressenti. Cependant, bien que les différents mésappariements entraînent des propriétés stériques différentes, l'ADN polymérase est toujours capable de les détecter et de les différencier de manière uniforme et de maintenir la fidélité dans la réplication de l'ADN. [12] La polymérisation de l'ADN est également critique pour de nombreux processus de mutagenèse et est largement utilisée dans les biotechnologies.

Modifier la structure

Les ADN polymérases connues ont une structure hautement conservée, ce qui signifie que leurs sous-unités catalytiques globales varient très peu d'une espèce à l'autre, indépendamment de leurs structures de domaine. Les structures conservées indiquent généralement des fonctions importantes et irremplaçables de la cellule, dont le maintien offre des avantages évolutifs. La forme peut être décrite comme ressemblant à une main droite avec les domaines du pouce, des doigts et de la paume. Le domaine palm semble fonctionner en catalysant le transfert de groupes phosphoryle dans la réaction de transfert de phosphoryle. L'ADN est lié à la paume lorsque l'enzyme est active. On pense que cette réaction est catalysée par un mécanisme à deux ions métalliques. Le domaine du doigt fonctionne pour lier les nucléosides triphosphates à la base de la matrice. Le domaine du pouce joue un rôle potentiel dans la processivité, la translocation et le positionnement de l'ADN. [13]

Processivité Modifier

La catalyse rapide de l'ADN polymérase est due à sa nature processive. La processivité est une caractéristique des enzymes qui fonctionnent sur des substrats polymères. Dans le cas de l'ADN polymérase, le degré de processivité fait référence au nombre moyen de nucléotides ajoutés chaque fois que l'enzyme se lie à une matrice. L'ADN polymérase moyenne nécessite environ une seconde pour localiser et lier une jonction amorce/matrice. Une fois liée, une ADN polymérase non processive ajoute des nucléotides à raison d'un nucléotide par seconde. [14] : 207-208 Les ADN polymérases processives, cependant, ajoutent plusieurs nucléotides par seconde, augmentant considérablement le taux de synthèse de l'ADN. Le degré de processivité est directement proportionnel à la vitesse de synthèse de l'ADN. Le taux de synthèse d'ADN dans une cellule vivante a d'abord été déterminé comme le taux d'allongement de l'ADN du phage T4 chez le phage infecté E. coli. Pendant la période d'augmentation exponentielle de l'ADN à 37 °C, la vitesse était de 749 nucléotides par seconde. [15]

La capacité de l'ADN polymérase à glisser le long de la matrice d'ADN permet une processivité accrue. Il y a une augmentation spectaculaire de la processivité au niveau de la fourche de réplication. Cette augmentation est facilitée par l'association de l'ADN polymérase avec des protéines connues sous le nom de pince à ADN coulissante. Les pinces sont de multiples sous-unités protéiques associées sous la forme d'un anneau. En utilisant l'hydrolyse de l'ATP, une classe de protéines connues sous le nom de protéines de chargement des pinces coulissantes ouvre la structure en anneau des pinces d'ADN coulissantes permettant la liaison et la libération du brin d'ADN. L'interaction protéine-protéine avec la pince empêche l'ADN polymérase de diffuser à partir de la matrice d'ADN, garantissant ainsi que l'enzyme se lie à la même jonction amorce/matrice et continue la réplication. [14] : 207-208 L'ADN polymérase change de conformation, augmentant l'affinité pour la pince lorsqu'elle lui est associée et diminuant l'affinité lorsqu'elle termine la réplication d'un tronçon d'ADN pour permettre la libération de la pince.

Sur la base de l'homologie de séquence, les ADN polymérases peuvent être subdivisées en sept familles différentes : A, B, C, D, X, Y et RT.

Certains virus codent également pour des ADN polymérases spéciales, telles que l'ADN polymérase du virus de l'hépatite B. Ceux-ci peuvent répliquer sélectivement l'ADN viral par divers mécanismes. Les rétrovirus codent pour une ADN polymérase inhabituelle appelée transcriptase inverse, qui est une ADN polymérase dépendante de l'ARN (RdDp). Il polymérise l'ADN à partir d'une matrice d'ARN.

Famille [16] Types d'ADN polymérase Taxons Exemples Caractéristique
UNE Polymérases réplicatives et réparatrices Eucaryote et procaryote ADN polymérase T7, Pol I, Pol γ, θ et ν Deux domaines d'exonucléase (3'-5' et 5'-3')
B Polymérases réplicatives et réparatrices Eucaryote et procaryote Pol II, Pol B, Pol ζ, Pol α, δ et ε Les virus 3'-5 exonucléase (relecture) utilisent une amorce de protéine
C Polymérases réplicatives Procaryote Pol III 3'-5 exonucléase (relecture)
Polymérases réplicatives Euryarchaeota PolD (hétérodimère DP1/DP2) [17] Pas de fonction "main", exonucléase 3'-5 de type ARN polymérase à double barillet (relecture)
X Polymérases réplicatives et réparatrices eucaryote Pol β, Pol σ, Pol λ, Pol μ et désoxynucléotidyl transférase terminale modèle optionnel 5' phosphatase (uniquement Pol β) faible caractéristique "main"
Oui Polymérases réplicatives et réparatrices Eucaryote et procaryote Pol ι, Pol κ, Pol η, [18] Pol IV et Pol V Synthèse translésionnelle [19]
RT Polymérases réplicatives et réparatrices Virus, rétrovirus et eucaryotes Télomérase, virus de l'hépatite B ARN-dépendant

Polymérase procaryote Modifier

Les polymérases procaryotes existent sous deux formes : la polymérase centrale et l'holoenzyme. La core polymérase synthétise l'ADN à partir de la matrice d'ADN, mais elle ne peut pas initier la synthèse seule ou avec précision. Holoenzyme initie avec précision la synthèse.

Pol I Modifier

Les polymérases procaryotes de la famille A comprennent l'enzyme ADN polymérase I (Pol I), qui est codée par le polA gène et omniprésent chez les procaryotes. Cette polymérase de réparation est impliquée dans la réparation par excision avec à la fois une activité exonucléase 3'-5' et 5'-3' et le traitement des fragments d'Okazaki générés pendant la synthèse des brins en retard. [20] Pol I est la polymérase la plus abondante, représentant >95% de l'activité polymérase dans E. coli pourtant, des cellules dépourvues de Pol I ont été trouvées, ce qui suggère que l'activité Pol I peut être remplacée par les quatre autres polymérases. Pol j'ajoute

15-20 nucléotides par seconde, montrant ainsi une faible processivité. Au lieu de cela, Pol I commence à ajouter des nucléotides à la jonction amorce d'ARN: matrice connue sous le nom d'origine de réplication (ori). Environ 400 pb en aval de l'origine, l'holoenzyme Pol III est assemblée et prend en charge la réplication à une vitesse et une nature hautement processives. [21]

Taq la polymérase est une enzyme thermostable de cette famille qui manque de capacité de relecture. [22]

Pol II Modifier

L'ADN polymérase II est une polymérase de la famille B codée par le gène polB. Pol II a une activité exonucléase 3'-5' et participe à la réparation de l'ADN, au redémarrage de la réplication pour contourner les lésions, et sa présence cellulaire peut passer de

200-300 pendant l'induction SOS. Pol II est également considéré comme une sauvegarde de Pol III car il peut interagir avec les protéines holoenzymes et assumer un niveau élevé de processivité. On pense que le rôle principal de Pol II est la capacité de diriger l'activité de la polymérase au niveau de la fourche de réplication et d'aider à bloquer les mésappariements terminaux de contournement de Pol III. [23]

Pfu L'ADN polymérase est une enzyme thermostable de cette famille trouvée dans l'archéon hyperthermophile Pyrococcus furiosus. [24] La classification détaillée divise la famille B des archées en B1, B2, B3, dans laquelle B2 est un groupe de pseudoenzymes. Pfu appartient à la famille B3. D'autres PolB trouvés dans les archées font partie des "Casposons", des transposons dépendants de Cas1. [25] Certains virus (y compris Φ29 ADN polymérase) et plasmides mitochondriaux portent également polB. [26]

Pol III Modifier

L'holoenzyme ADN polymérase III est la principale enzyme impliquée dans la réplication de l'ADN dans E. coli et appartient à la famille C des polymérases. Il se compose de trois assemblages : le noyau pol III, le facteur de processivité de la pince coulissante bêta et le complexe de chargement de pince. Le noyau se compose de trois sous-unités : , le centre d'activité de la polymérase, , correcteur exonucléolytique et , qui peut agir comme un stabilisateur pour ɛ. Le facteur de processivité de la pince coulissante bêta est également présent en double, un pour chaque noyau, pour créer une pince qui renferme l'ADN permettant une processivité élevée. [27] Le troisième assemblage est un complexe de chargeurs de pinces à sept sous-unités (τ2γδδ′χψ).

L'ancien manuel "modèle de trombone" décrit un complexe d'allongement avec deux équivalents de l'enzyme de base à chaque fourche de réplication (RF), un pour chaque brin, le retard et le leader. [23] Cependant, des preuves récentes d'études sur une molécule unique indiquent une moyenne de trois équivalents stoechiométriques de l'enzyme de base à chaque RF pour Pol III et son homologue dans B. subtilis, PolC. [28] La microscopie à fluorescence in-cell a révélé que la synthèse du brin principal peut ne pas être complètement continue, et Pol III* (c'est-à-dire les sous-unités holoenzyme α, ε, , et sans la pince coulissante ß2) dissociation des RF actifs. [29] Dans ces études, le taux de rotation des fourches de réplication était d'environ 10 s pour Pol III*, 47 s pour la pince coulissante ß2 et 15 m pour l'hélicase DnaB. Cela suggère que l'hélicase DnaB peut rester associée de manière stable aux RF et servir de point de nucléation pour l'holoenzyme compétente. In vitro des études sur une molécule unique ont montré que la Pol III* a un taux élevé de renouvellement des RF lorsqu'elle est en excès, mais reste associée de manière stable aux fourches de réplication lorsque la concentration est limitante. [29] Une autre étude à molécule unique a montré que l'activité de l'hélicase DnaB et l'allongement des brins peuvent se dérouler avec une cinétique stochastique découplée. [29]

Pol IV Modifier

Dans E. coli, l'ADN polymérase IV (Pol IV) est une ADN polymérase sujette aux erreurs impliquée dans la mutagenèse non ciblée. [30] Pol IV est une polymérase de la famille Y exprimée par le gène dinB qui est activé via l'induction SOS causée par des polymérases bloquées à la fourche de réplication. Pendant l'induction SOS, la production de Pol IV est décuplée et l'une des fonctions pendant ce temps est d'interférer avec la processivité de l'holoenzyme Pol III. Cela crée un point de contrôle, arrête la réplication et laisse le temps de réparer les lésions de l'ADN via la voie de réparation appropriée. [31] Une autre fonction de Pol IV est d'effectuer la synthèse de la translésion à la fourche de réplication bloquée, par exemple en contournant les adduits N2-désoxyguanine à un rythme plus rapide que la traversée de l'ADN non endommagé. Les cellules dépourvues du gène dinB ont un taux plus élevé de mutagenèse causée par des agents endommageant l'ADN. [32]

Pol V Modifier

L'ADN polymérase V (Pol V) est une ADN polymérase de la famille Y qui est impliquée dans les mécanismes de réparation de l'ADN de la réponse SOS et de la synthèse translésionnelle. [33] La transcription de Pol V via les gènes umuDC est hautement régulée pour ne produire que Pol V lorsque l'ADN endommagé est présent dans la cellule générant une réponse SOS. Les polymérases bloquées provoquent la liaison de RecA à l'ADNsb, ce qui provoque l'autodigeste de la protéine LexA. LexA perd alors sa capacité à réprimer la transcription de l'opéron umuDC. La même nucléoprotéine RecA-ssDNA modifie post-traductionnellement la protéine UmuD en protéine UmuD'. UmuD et UmuD' forment un hétérodimère qui interagit avec UmuC, qui à son tour active l'activité catalytique de la polymérase d'umuC sur l'ADN endommagé. [34] Dans E. coli, un modèle de « ceinture à outils » de polymérase pour la commutation de pol III avec pol IV à une fourche de réplication bloquée, où les deux polymérases se lient simultanément à la pince , a été proposé. [35] Cependant, l'implication de plus d'une polymérase TLS agissant successivement pour contourner une lésion n'a pas encore été démontrée chez E. coli. De plus, Pol IV peut catalyser à la fois l'insertion et l'extension avec une grande efficacité, tandis que la pol V est considérée comme la principale polymérase SOS TLS. Un exemple est le contournement de la réticulation intra-brin guanine thymine où il a été montré sur la base de la différence des signatures mutationnelles des deux polymérases, que pol IV et pol V sont en compétition pour le TLS de la réticulation intra-brin. [35]

Famille D Modifier

En 1998, la famille D de l'ADN polymérase a été découverte dans Pyrococcus furiosus et Methanococcus jannaschii. [36] Le complexe PolD est un hétérodimère de deux chaînes, chacune codée par DP1 (petite relecture) et DP2 (grand catalytique). Contrairement à d'autres ADN polymérases, la structure et le mécanisme du noyau catalytique DP2 ressemblent à ceux des ARN polymérases multi-sous-unités. L'interface DP1-DP2 ressemble à celle du doigt de zinc de la polymérase eucaryote de classe B et de sa petite sous-unité. [17] DP1, une exonucléase de type Mre11, [37] est probablement le précurseur d'une petite sous-unité de Pol α et ε, fournissant des capacités de relecture désormais perdues chez les eucaryotes. [25] Son domaine HSH N-terminal est similaire aux protéines AAA, en particulier la sous-unité Pol III δ et RuvB, en termes de structure. [38] DP2 a un domaine KH de classe II. [17] Pyrococcus abyssi polD est plus stable à la chaleur et plus précis que Taq polymérase, mais n'a pas encore été commercialisé. [39] Il a été proposé que l'ADN polymérase de la famille D ait été la première à évoluer dans les organismes cellulaires et que la polymérase réplicative du Last Universal Cellular Ancestor (LUCA) appartenait à la famille D. [40]

ADN polymérase eucaryote Modifier

Polymérases β, λ, , μ (beta, lambda, sigma, mu) et TdT Modifier

Les polymérases de la famille X contiennent la bien connue polymérase eucaryote pol (bêta), ainsi que d'autres polymérases eucaryotes telles que Pol σ (sigma), Pol λ (lambda), Pol μ (mu) et terminal désoxynucléotidyl transférase (TdT). Les polymérases de la famille X se trouvent principalement chez les vertébrés, et quelques-unes se trouvent dans les plantes et les champignons. Ces polymérases ont des régions hautement conservées qui incluent deux motifs hélice-épingle-hélice qui sont impératifs dans les interactions ADN-polymérase. Un motif est situé dans le domaine de 8 kDa qui interagit avec l'ADN en aval et un motif est situé dans le domaine du pouce qui interagit avec le brin d'amorce. Pol β, codé par le gène POLB, est requis pour la réparation par excision de bases en patch court, une voie de réparation de l'ADN qui est essentielle pour réparer les bases alkylées ou oxydées ainsi que les sites abasiques. Pol λ et Pol μ, codés respectivement par les gènes POLL et POLM, sont impliqués dans la jonction terminale non homologue, un mécanisme de jonction des cassures double brin de l'ADN dues respectivement au peroxyde d'hydrogène et aux rayonnements ionisants. La TdT n'est exprimée que dans le tissu lymphoïde et ajoute "n nucléotides" aux cassures double brin formées lors de la recombinaison V(D)J pour favoriser la diversité immunologique. [41]

Polymérases α, δ et ε (alpha, delta et epsilon) Modifier

Pol α (alpha), Pol δ (delta) et Pol ε (epsilon) sont des membres de la famille B des polymérases et sont les principales polymérases impliquées dans la réplication de l'ADN nucléaire. Le complexe Pol α (complexe pol α-ADN primase) se compose de quatre sous-unités : la sous-unité catalytique POLA1, la sous-unité régulatrice POLA2, et les petites et grandes sous-unités primase PRIM1 et PRIM2 respectivement. Une fois que la primase a créé l'amorce d'ARN, Pol α commence la réplication en allongeant l'amorce avec

20 nucléotides. [42] En raison de sa processivité élevée, Pol δ reprend la synthèse des brins principaux et retardés de Pol α. [14] : 218–219 Pol δ est exprimé par les gènes POLD1, créant la sous-unité catalytique, POLD2, POLD3 et POLD4 créant les autres sous-unités qui interagissent avec l'antigène nucléaire proliférant des cellules (PCNA), qui est un clamp d'ADN qui permet à Pol δ posséder la processivité. [43] Pol ε est codé par le gène POLE1, la sous-unité catalytique, POLE2 et POLE3. Il a été rapporté que la fonction de Pol ε est d'étendre le brin principal pendant la réplication, [44] [45] tandis que Pol δ réplique principalement le brin retardé. Cependant, des preuves récentes suggèrent que Pol δ pourrait avoir un rôle dans la réplication du brin principal. aussi de l'ADN. [46] La région C-terminale de la "relique de la polymérase" de Pol ε, bien qu'elle soit inutile pour l'activité de la polymérase, [47] est considérée comme essentielle à la vitalité cellulaire. On pense que la région C-terminale fournit un point de contrôle avant d'entrer dans l'anaphase, assure la stabilité de l'holoenzyme et ajoute des protéines à l'holoenzyme nécessaires à l'initiation de la réplication. [48] ​​Pol ε a un domaine "paume" plus grand qui fournit une haute processivité indépendamment de PCNA. [47]

Par rapport aux autres polymérases de la famille B, la famille des exonucléases DEDD responsable de la relecture est inactivée dans Pol α. [25] Pol ε est unique en ce qu'il possède deux domaines à doigt de zinc et une copie inactive d'une autre polymérase de la famille B dans son C-terminal. La présence de ce doigt de zinc a des implications dans les origines d'Eukaryota, qui dans ce cas est placé dans le Asgard groupe avec la polymérase des archées B3. [49]

Polymérases η, ι et κ (eta, iota et kappa) Modifier

Pol η (eta), Pol ι (iota) et Pol κ (kappa), sont des ADN polymérases de la famille Y impliquées dans la réparation de l'ADN par synthèse de traduction et codées par les gènes POLH, POLI et POLK respectivement. Les membres de la famille Y ont cinq motifs communs pour aider à lier le substrat et l'extrémité de l'amorce et ils incluent tous les domaines typiques du pouce, de la paume et des doigts de la main droite avec des domaines ajoutés comme le petit doigt (LF), le domaine associé à la polymérase (PAD) ou poignet. Le site actif, cependant, diffère entre les membres de la famille en raison des différentes lésions réparées. Les polymérases de la famille Y sont des polymérases de basse fidélité, mais il a été prouvé qu'elles faisaient plus de bien que de mal, car les mutations qui affectent la polymérase peuvent provoquer diverses maladies, telles que le cancer de la peau et le Xeroderma Pigmentosum Variant (XPS). L'importance de ces polymérases est mise en évidence par le fait que le gène codant pour l'ADN polymérase est appelé XPV, car la perte de ce gène entraîne la maladie Xeroderma Pigmentosum Variant. Pol η est particulièrement important pour permettre une synthèse précise par translésion des dommages à l'ADN résultant du rayonnement ultraviolet. La fonctionnalité de Pol κ n'est pas complètement comprise, mais les chercheurs ont trouvé deux fonctions probables. On pense que Pol κ agit comme un extenseur ou un insérateur d'une base spécifique au niveau de certaines lésions de l'ADN. Les trois polymérases de synthèse de translésion, ainsi que Rev1, sont recrutées dans les lésions endommagées via des ADN polymérases réplicatives bloquées. Il existe deux voies de réparation des dommages qui amènent les chercheurs à conclure que la voie choisie dépend du brin qui contient les dommages, le brin principal ou le brin retardé. [50]

Polymérases Rev1 et (zeta) Modifier

Pol ζ une autre polymérase de la famille B, est constituée de deux sous-unités Rev3, la sous-unité catalytique et Rev7 (MAD2L2), qui augmente la fonction catalytique de la polymérase et est impliquée dans la synthèse de la translésion. Pol ζ manque d'activité exonucléase 3' à 5', est unique en ce qu'il peut étendre des amorces avec des mésappariements terminaux. Rev1 a trois régions d'intérêt dans le domaine BRCT, le domaine de liaison à l'ubiquitine et le domaine C-terminal et a la capacité de transférase dCMP, qui ajoute des lésions opposées à la désoxycytidine qui bloqueraient les polymérases réplicatives Pol δ et Pol ε. Ces polymérases bloquées activent des complexes d'ubiquitine qui à leur tour dissocient les polymérases de réplication et recrutent Pol ζ et Rev1. Ensemble, Pol ζ et Rev1 ajoutent de la désoxycytidine et Pol ζ s'étend au-delà de la lésion. Par un processus encore indéterminé, Pol ζ se dissocie et les polymérases de réplication se réassocient et continuent la réplication. Pol ζ et Rev1 ne sont pas nécessaires pour la réplication, mais la perte du gène REV3 chez la levure bourgeonnante peut entraîner une sensibilité accrue aux agents endommageant l'ADN en raison de l'effondrement des fourches de réplication où les polymérases de réplication sont bloquées. [51]

Télomérase Modifier

La télomérase est une ribonucléoprotéine qui fonctionne pour répliquer les extrémités des chromosomes linéaires, car l'ADN polymérase normale ne peut pas répliquer les extrémités ou les télomères. Le surplomb 3' simple brin du chromosome double brin avec la séquence 5'-TTAGGG-3' recrute la télomérase. La télomérase agit comme les autres ADN polymérases en prolongeant l'extrémité 3', mais, contrairement aux autres ADN polymérases, la télomérase ne nécessite pas de matrice. La sous-unité TERT, un exemple de transcriptase inverse, utilise la sous-unité ARN pour former la jonction amorce-matrice qui permet à la télomérase d'étendre l'extrémité 3' des extrémités des chromosomes. On pense que la diminution progressive de la taille des télomères à la suite de nombreuses réplications au cours d'une vie est associée aux effets du vieillissement. [14] : 248–249

Polymérases γ, θ et ν (gamma, thêta et nu) Modifier

Pol γ (gamma), Pol θ (thêta) et Pol ν (nu) sont des polymérases de la famille A. Pol γ, codée par le gène POLG, a longtemps été considérée comme la seule polymérase mitochondriale. Cependant, des recherches récentes montrent qu'au moins Pol β (bêta), une polymérase de la famille X, est également présente dans les mitochondries. [52] [53] Toute mutation qui conduit à une Pol γ limitée ou non fonctionnelle a un effet significatif sur l'ADNmt et est la cause la plus fréquente de troubles mitochondriaux héréditaires autosomiques. [54] Pol γ contient un domaine de polymérase C-terminal et un domaine d'exonucléase N-terminal 3'-5' qui sont connectés via la région de liaison, qui lie la sous-unité accessoire. La sous-unité accessoire se lie à l'ADN et est nécessaire à la processivité de Pol γ. La mutation ponctuelle A467T dans la région de liaison est responsable de plus d'un tiers de tous les troubles mitochondriaux associés à Pol γ. [55] Alors que de nombreux homologues de Pol θ, codés par le gène POLQ, se trouvent chez les eucaryotes, sa fonction n'est pas clairement comprise. La séquence d'acides aminés dans l'extrémité C-terminale est ce qui classe Pol θ comme polymérase de la famille A, bien que le taux d'erreur pour Pol θ soit plus étroitement lié aux polymérases de la famille Y. Pol θ étend les terminaisons d'amorces incompatibles et peut contourner les sites abasiques en ajoutant un nucléotide. Il possède également une activité de désoxyribophosphodiestérase (dRPase) dans le domaine de la polymérase et peut montrer une activité ATPase à proximité immédiate de l'ADN simple brin. [56] Pol ν (nu) est considéré comme le moins efficace des enzymes polymérases. [57] Cependant, l'ADN polymérase nu joue un rôle actif dans la réparation de l'homologie lors des réponses cellulaires aux réticulations, remplissant son rôle dans un complexe avec l'hélicase. [57]

Les plantes utilisent deux polymérases de la famille A pour copier à la fois les génomes mitochondriaux et plastidiques. Ils ressemblent plus à la Pol I bactérienne qu'à la Pol γ des mammifères. [58]

Transcriptase inverse Modifier

Les rétrovirus codent pour une ADN polymérase inhabituelle appelée transcriptase inverse, qui est une ADN polymérase dépendante de l'ARN (RdDp) qui synthétise l'ADN à partir d'une matrice d'ARN. La famille des transcriptases inverses contient à la fois une fonctionnalité ADN polymérase et une fonctionnalité RNase H, qui dégrade l'ARN apparié en ADN. Un exemple de rétrovirus est le VIH. [14] : La transcriptase inverse est couramment utilisée dans l'amplification d'ARN à des fins de recherche. En utilisant une matrice d'ARN, la PCR peut utiliser la transcriptase inverse, créant une matrice d'ADN. Cette nouvelle matrice d'ADN peut ensuite être utilisée pour une amplification PCR typique. Les produits d'une telle expérience sont donc des produits de PCR amplifiés à partir d'ARN. [9]

Chaque particule de rétrovirus VIH contient deux génomes d'ARN, mais, après une infection, chaque virus ne génère qu'un seul provirus. [59] Après infection, la transcription inverse s'accompagne d'une commutation de matrice entre les deux copies du génome (recombinaison de choix de copie). [59] De 5 à 14 événements de recombinaison par génome se produisent à chaque cycle de réplication. [60] La commutation de modèle (recombinaison) semble être nécessaire pour maintenir l'intégrité du génome et comme mécanisme de réparation pour récupérer les génomes endommagés. [61] [59]

ADN polymérase du bactériophage T4 Modifier

Le bactériophage (phage) T4 code pour une ADN polymérase qui catalyse la synthèse d'ADN dans une direction 5 'à 3'. [62] La polymérase du phage a également une activité exonucléase qui agit dans une direction 3' à 5', [63] et cette activité est utilisée dans la relecture et l'édition des bases nouvellement insérées. [64] On a observé qu'un mutant de phage avec une ADN polymérase sensible à la température, lorsqu'il était cultivé à des températures permissives, subissait une recombinaison à des fréquences environ deux fois supérieures à celles du phage de type sauvage. [65]

Il a été proposé qu'une altération mutationnelle de l'ADN polymérase du phage puisse stimuler la commutation de brin de matrice (recombinaison de choix de copie) pendant la réplication. [65]


Défis avec les ADN polymérases traditionnelles

Les ADN polymérases traditionnelles utilisées dans la PCR ont généralement une faible processivité et n'intègrent que quelques nucléotides par événement de liaison. En effet, ils manquent souvent des facteurs de processivité de la polymérase, ce qui entraîne :

  • Nécessitant une minute ou plus pour amplifier 1 kb de matrice d'ADN,
  • Être incapable d'amplifier des amplicons de plus de 4 à 5 ko,
  • Être affecté par des inhibiteurs tels que l'éthanol, l'EDTA ou d'autres facteurs dans les échantillons d'ADN.

La faible processivité des enzymes PCR peut être un facteur limitant pour l'efficacité de la PCR. Par conséquent, l'augmentation de la processivité de l'ADN polymérase est importante pour améliorer les performances de la PCR et permettre de nouvelles applications.


ADN polymérases

Le maintien de l'information intégrée dans la séquence d'ADN génomique est essentiel pour la vie. Les ADN polymérases jouent un rôle central dans les processus complexes qui maintiennent l'intégrité génétique. Outre leurs tâches in vivo, les ADN polymérases sont les chevaux de bataille dans de nombreuses applications biotechnologiques telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le clonage d'ADNc, le séquençage du génome, les diagnostics basés sur les acides nucléiques et dans les techniques d'analyse de l'ADN ancien et autrement endommagé. De plus, certaines maladies sont liées à des défauts de l'ADN polymérase, et la chimiothérapie par inhibition des ADN polymérases est utilisée pour lutter contre les infections par le VIH, l'herpès et les hépatites B et C. Nous avons récemment assisté à la découverte d'une abondance de nouvelles ADN polymérases dans des virus, des bactéries, des archées et des eucaryotes avec des propriétés spécialisées dont les fonctions physiologiques commencent seulement à être comprises. Ce livre résume les connaissances actuelles sur ces enzymes fascinantes. Il est destiné à un large public allant des scientifiques fondamentaux aux laboratoires de diagnostic et aux cliniciens qui souhaitent mieux comprendre ces enzymes fascinantes.


Partie 2 : Mécanismes de réplication de l'ADN chromosomique : Initiation de la réplication de l'ADN

00:00:0809 Bonjour. Je m'appelle Steve Bell,
00:00:0915 et je suis professeur de biologie au MIT
00:00:1123 et un enquêteur du Howard Hughes Medical Institute.
00:00:1422 Et ce dont j'aimerais vous parler maintenant
00:00:1612 sont les mécanismes contrôlant
00:00:2019 l'initiation de la réplication de l'ADN au niveau des chromosomes.
00:00:2210 Ceci est la suite de ma précédente discussion
00:00:2528 des événements qui se produisent au niveau de la fourche de réplication.
00:00:3201 Maintenant, ce processus implique deux événements clés.
00:00:3319 Tout d'abord, déroulez une partie de l'ADN
00:00:3703 pour créer des modèles simple brin
00:00:3911 pour assembler le réplisome.
00:00:4028 Et, deuxièmement, vous devez
00:00:4300 assembler deux copies du réplisome,
00:00:4426 parce que tout génomique
00:00:4805 ou origines chromosomiques de réplication
00:00:4924 initie la réplication de l'ADN de manière bidirectionnelle,
00:00:5300 ce qui signifie qu'ils.
00:00:5406 les réplisomes qui sont assemblés
00:00:5707 s'éloigner dans les deux sens
00:00:5923 à partir du site de départ de la réplication.
00:01:0116 Ainsi, les sites de départ de la réplication de l'ADN
00:01:0304 sont appelées origines de réplication,
00:01:0613 et c'est là que le premier ADN simple brin est formé
00:01:0808 et où se produit la première synthèse d'ADN.
00:01:0923 Ils peuvent tirer avec diverses soi-disant efficacités,
00:01:1307 qui est défini comme le pourcentage de divisions cellulaires
00:01:1528 dans lequel une origine initie la réplication de l'ADN.
00:01:1900 Certaines origines ont des rendements élevés,
00:01:2125 d'autres ont plus bas,
00:01:2306 et je vous en dirai plus dans un instant.
00:01:2516 Maintenant, tout l'ADN qui est répliqué
00:01:2804 par les deux réplisomes qui se forment
00:01:2928 à chaque origine de réplication.
00:01:3117 et, un rappel,
00:01:3313 toutes les origines chromosomiques sont bidirectionnelles.
00:01:3505 cet ADN s'appelle un réplicon.
00:01:3721 Et cela découle d'un modèle proposé en 1963
00:01:4025 par Jacob, Brenner et Cuzin
00:01:4218 pour le mécanisme d'initiation
00:01:4501 de réplication bactérienne.
00:01:4704 C'est un modèle très simple.
00:01:4824 Ils n'ont proposé que deux composants :
00:01:5017 le réplicateur et l'initiateur.
00:01:5221 Le réplicateur est les séquences d'ADN
00:01:5520 qui sont nécessaires pour initier la réplication de l'ADN.
00:01:5807 L'initiateur est une protéine
00:02:0021 qui a été proposé de se lier au réplicateur
00:02:0224 et déclencher l'initiation de la réplication de l'ADN.
00:02:0624 Maintenant, le réplicateur,
00:02:0906 bien qu'il chevauche généralement l'origine de la réplication,
00:02:1024 n'est pas la même chose,
00:02:1225 et c'est à la place toutes les séquences
00:02:1512 qui sont requis.
00:02:1611 Et c'est parfois un peu difficile à comprendre,
00:02:1810 mais pensez-y en termes de transcription,
00:02:2027 où le promoteur est toutes les séquences
00:02:2329 nécessaire pour réguler correctement l'initiation de la transcription
00:02:2707 du gène,
00:02:2818 mais le site de démarrage de la transcription
00:02:3008 est une séquence très spécifique
00:02:3211 auquel l'initiation se produit réellement.
00:02:3406 Dans cette analogie,
00:02:3524 le promoteur est équivalent au réplicateur,
00:02:3805 et le site de démarrage de la transcription
00:02:3922 équivaut à l'origine de réplication.
00:02:4308 Alors, voici à quoi ressemblent les origines
00:02:4720 et à quoi ressemblent les réplicateurs.
00:02:4915 comment sont-ils distribués sur les chromosomes ?
00:02:5112 Donc, dans E. coli,
00:02:5500 sans surprise, où il y a une seule origine de réplication,
00:02:5613 les origines sont 100% efficaces.
00:02:5822 Si une origine ne se déclenche pas,
00:03:0018 cela signifie l'une des deux cellules filles
00:03:0202 n'obtient pas un chromosome entier.
00:03:0513 C'est différent dans les cellules eucaryotes,
00:03:0713 où il y a beaucoup, beaucoup d'origines.
00:03:0903 Ce que l'on trouve, c'est que la plupart des origines
00:03:1110 ne démarre pas 100% du temps,
00:03:1307 mais ça va,
00:03:1501 parce que quand ils ne démarrent pas,
00:03:1624 les fourches de réplication de chaque côté
00:03:1901 se répliquera dans la région
00:03:2029 qu'ils auraient reproduit autrement,
00:03:2300 car il y a beaucoup de capacité de réplication excédentaire.
00:03:2629 Il est important de noter que
00:03:2826 toute origine qui n'initie pas
00:03:3011 mais est répliqué
00:03:3123 est désactivé.
00:03:3308 Donc, vous n'avez jamais d'initié d'origine
00:03:3512 après qu'il ait été répliqué par un fork adjacent.
00:03:3817 Maintenant, une autre caractéristique intéressante de la réplication eucaryote
00:03:4200 c'est quand les origines commencent
00:03:4506 est caractéristique de différentes origines.
00:03:4612 Certains commenceront tôt pendant la phase S du cycle cellulaire,
00:03:4929 le temps dans le cycle cellulaire eucaryote
00:03:5221 lorsque la réplication de l'ADN se produit,
00:03:5420 d'autres se répliqueront au milieu,
00:03:5600 et d'autres encore se répliqueront à la fin de la phase S.
00:03:5824 Et ce n'est pas clair au départ
00:04:0203 pourquoi vous voudriez distribuer ceci.
00:04:0316 Pourquoi ne pas tout reproduire d'un coup ?
00:04:0522 Mais c'est plus clair quand on pense au fait
00:04:0829 que parfois vous aurez des dommages à votre ADN
00:04:1109 -- cela peut se produire par
00:04:1307 un changement soudain dans votre environnement --
00:04:1707 et si vous le faites et que vous arrêtez deux fourchettes,
00:04:1900 et ils n'ont pas reproduit l'ADN intermédiaire,
00:04:2228 le seul moyen de sauver cette situation
00:04:2510 est d'initier la réplication
00:04:2709 entre ces deux fourchettes
00:04:2825 et créer deux nouveaux réplisomes
00:04:3011 qui peut combler cette lacune.
00:04:3126 Et en réservant un sous-ensemble d'origines
00:04:3410 pour démarrer en fin de phase S,
00:04:3610 vous augmenterez la probabilité
00:04:3826 que vous pouvez corriger un écart
00:04:4027 qui est causé par une sorte de dommage à l'ADN
00:04:4225 et blocage des fourches de réplication.
00:04:4526 D'accord?
00:04:4724 Donc, nous avons parlé des origines,
00:04:5024 parlons de la façon dont l'initiation se produit ?
00:04:5210 Donc, nous allons commencer par l'initiation de la réplication de l'ADN chez les bactéries.
00:04:5501 Voici une illustration de l'origine de réplication d'E. coli.
00:04:5913 Il a 5 exemplaires
00:05:0123 des répétitions dites 9-mer,
00:05:0304 qui sont les sites de liaison
00:05:0508 pour la protéine initiatrice bactérienne,
00:05:0621 qui s'appelle DnaA,
00:05:0814 et 3 exemplaires de la reprise 13-mer,
00:05:1103 qui est riche en AT,
00:05:1226 séquence d'ADN facilement déroulée.
00:05:1526 Maintenant, quand l'ADN est présent,
00:05:2014 qui est. et actif dans la cellule,
00:05:2200 et c'est une étape très réglementée
00:05:2403 en cours dans les cellules bactériennes,
00:05:2624 il se liera aux séquences 9-mer.
00:05:3110 C'est à son tour forme un filament hélicoïdal,
00:05:3414 qui déforme l'ADN,
00:05:3619 provoquant l'ADN qu'il est lié
00:05:3913 pour avoir une superhélicité positive,
00:05:4028 et l'ADN adjacent à, de manière compensatoire,
00:05:4428 génèrent une superhélicité négative,
00:05:4615 qui favorise le dénouement
00:05:4906 des régions 13-mer adjacentes.
00:05:5126 Fait intéressant,
00:05:5320 l'ADN qui forme ce filament
00:05:5519 peut en fait étendre ce filament
00:05:5724 en liant l'ADN simple brin
00:05:5918 plutôt que l'ADN double brin,
00:06:0123 bien qu'il ne le fasse que sur le brin supérieur,
00:06:0408 comme illustré ici,
00:06:0603 pas sur les deux brins.
00:06:0807 Maintenant, à ce stade,
00:06:1003 nous avons accompli un événement important,
00:06:1108 qui consiste à dérouler l'ADN à l'origine,
00:06:1329 mais nous manquons clairement
00:06:1528 une grande partie du reste de la machinerie,
00:06:1713 et la prochaine chose dont nous avons besoin pour lancer la réplication
00:06:2020 est de charger l'hélicase réplicative.
00:06:2301 avec hélicase DnaB,
00:06:2507 l'hélicase réplicative.
00:06:2626 Maintenant, il s'avère qu'il n'arrive pas à l'origine tout seul
00:06:3029 il est lié à une autre protéine, l'ADNC,
00:06:3300 qui est un soi-disant chargeur d'hélicase,
00:06:3504 et il a de nombreuses propriétés importantes
00:06:3709 qui le rendent idéal pour charger l'hélicase sur l'ADN.
00:06:4122 Ainsi, une propriété est lorsque DnaC est lié à DnaB,
00:06:4604 il inactive son activité hélicase,
00:06:4710 l'empêchant d'agir dans les régions non originaires du génome.
00:06:5119 Deuxièmement, DnaC provoque l'anneau DnaB
00:06:5513 pour ouvrir de telle sorte qu'il a
00:06:5817 assez de place pour s'adapter
00:07:0102 un ADN simple brin
00:07:0403 afin qu'il puisse accéder à
00:07:0529 le canal central de la structure annulaire hexamérique.
00:07:1009 La troisième propriété importante est que
00:07:1221 DnaC a une affinité pour DnaA,
00:07:1508 qui recrute le complexe DnaB-C
00:07:1816 à l'ADN simple brin
00:07:2023 et le permet maintenant
00:07:2317 encerclent l'ADN,
00:07:2504 donc il se lie de telle sorte qu'il va maintenant
00:07:2705 encerclent l'ADN simple brin.
00:07:2904 Maintenant, surtout,
00:07:3100 non seulement le complexe DnaB-C
00:07:3305 charge sur le brin supérieur
00:07:3513 auquel est associé l'ADNA,
00:07:3716 mais il est également chargé sur le brin inférieur,
00:07:3908 mais dans l'orientation opposée,
00:07:4026 pour qu'il quitte la réplication.
00:07:4314 l'origine dans la direction opposée.
00:07:4603 Donc, vous pouvez le voir en haut
00:07:4802 ça va se déplacer vers la gauche,
00:07:4919 en bas, ça va se déplacer vers la droite.
00:07:5304 Maintenant, nous ne comprenons pas en détail
00:07:5508 comment ce deuxième complexe DnaB-C est recruté,
00:07:5808 bien qu'il existe des théories qui suggèrent que
00:08:0026 DnaA, qui a également une affinité pour DnaB,
00:08:0411 peut utiliser cette interaction
00:08:0617 pour recruter le deuxième complexe B-C
00:08:0805 dans l'orientation opposée.
00:08:1025 Maintenant, à ce stade,
00:08:1203 vous vous souviendrez que le complexe B-C est inactif,
00:08:1505 donc l'hélicase n'est pas encore active.
00:08:1725 Néanmoins, vous vous souviendrez que le
00:08:2105 interaction entre l'ADN primase
00:08:2302 et l'hélicase
00:08:2418 stimule la primase pour synthétiser de nouvelles amorces,
00:08:2702 et c'est la prochaine étape de ce processus.
00:08:2911 L'ADN primase est recrutée,
00:08:3202 se lie à l'hélicase,
00:08:3318 et synthétise une amorce,
00:08:3520 et quelque chose à propos de ce processus
00:08:3800 provoque la libération des sous-unités DnaC.
00:08:4025 Encore une fois, nous ne comprenons pas cela en détail,
00:08:4304 mais c'est clairement l'étape à laquelle cela se produit,
00:08:4507 et maintenant vous avez des hélicases actives,
00:08:4708 qui peut se déplacer à droite et à gauche
00:08:5007 -- en haut à gauche, en bas à droite --
00:08:5214 pour dérouler plus d'ADN,
00:08:5409 afin que vous obteniez une région étendue étendue.
00:08:5721 Maintenant, à ce stade, nous avons deux jonctions amorce-modèle
00:09:0111 qui peut être reconnu par l'holoenzyme ADN polymérase III,
00:09:0406 pinces coulissantes de charge,
00:09:0617 et puis les pinces coulissantes peuvent être reconnues
00:09:0807 par l'une des trois enzymes ADN polymérase III.
00:09:1206 Il initiera alors la synthèse du brin principal.
00:09:1514 Ensuite, à un certain taux déterminé par l'affinité
00:09:1822 entre l'hélicase et la primase,
00:09:2020 une deuxième amorce sera synthétisée.
00:09:2223 Cela sera reconnu par le chargeur de pinces
00:09:2428 et une seconde sous-unité polymérase,
00:09:2707 et puis vous avez initié
00:09:2913 synthèse des brins en avance et en retard,
00:09:3116 et c'est vraiment le point de départ
00:09:3306 dont nous avons discuté en termes de fonction
00:09:3524 du réplisome pendant l'élongation,
00:09:3723 pour que vous sachiez ce qui se passe à partir d'ici.
00:09:4015 Maintenant, je veux faire quelques autres points
00:09:4307 à ce stade.
00:09:4403 Vous remarquerez qu'il n'y avait qu'un seul
00:09:4722 protéine de liaison à l'ADN spécifique à la séquence impliquée dans ce processus.
00:09:4909 La plupart du processus est piloté
00:09:5209 par l'une ou l'autre des interactions protéine-protéine
00:09:5418 ou non spécifique
00:09:5629 ou des interactions protéine-ADN spécifiques à la structure.
00:09:5905 Ainsi, par exemple,
00:10:0107 la reconnaissance de la jonction amorce-modèle
00:10:0229 est une séquence non spécifique,
00:10:0419 mais très spécifique pour la structure particulière,
00:10:0800 celui d'une amorce avec le 3' OH disponible
00:10:1118 et une région monocaténaire adjacente
00:10:1324 pour l'ADN polymérase avec laquelle s'engager.
00:10:1707 OK ?
00:10:1808 Et c'est vrai aussi pour la primase
00:10:2006 en interaction avec l'hélicase
00:10:2203 et l'holoenzyme ADN polymérase III
00:10:2419 interagissant également avec l'hélicase.
00:10:2707 Donc, ceci n'est pas construit par
00:10:2917 une série d'interactions spécifiques à une séquence,
00:10:3113 mais par une série de
00:10:3324 interactions protéine-protéine spécifiques
00:10:3515 ou interactions spécifiques à la structure.
00:10:3827 OK, c'est donc l'initiation des bactéries.
00:10:4108 Je veux attirer mon attention, maintenant,
00:10:4323 à l'initiation dans les cellules eucaryotes,
00:10:4604 ce qui est nettement plus complexe.
00:10:4928 Donc, ceci n'est qu'un aperçu des événements
00:10:5216 de réplication d'ADN eucaryote,
00:10:5407 et je veux d'abord discuter de la vue d'ensemble,
00:10:5608 alors je vais décrire
00:10:5810 comment ces événements sont réglementés,
00:11:0003, puis je vais vous expliquer les étapes détaillées
00:11:0218 de cet événement d'initiation.
00:11:0505 Donc, la première étape de ce processus
00:11:0710 ne se produit pas pendant la phase S du cycle cellulaire,
00:11:0829 lorsque la synthèse d'ADN se produit,
00:11:1021 mais pendant la phase G1 du cycle cellulaire,
00:11:1311 afin que les préparatifs pour la réplication se produisent
00:11:1529 bien avant l'ajout de tout nucléotide
00:11:1901 à n'importe quel brin d'ADN.
00:11:2127 Pendant ce processus de chargement de l'hélicase dans G1,
00:11:2604 l'hélicase réplicative, ce complexe Mcm2-7,
00:11:2901 est assemblé autour de l'ADN à chaque origine.
00:11:3300 En fait, cela marque toutes les origines potentielles dans les cellules
00:11:3701 et est souvent appelé licence d'origine
00:11:3911 ou formation complexe parfois pré-réplicative.
00:11:4313 Trois protéines supplémentaires sont nécessaires pour accomplir cela.
00:11:4725 En plus de l'hélicase,
00:11:4910 le complexe de reconnaissance d'origine,
00:11:5120 Cdc6,
00:11:5305 et Cdt1,
00:11:5501 et j'aurai beaucoup plus à dire à leur sujet dans quelques minutes.
00:11:5817 Au fur et à mesure que les cellules passent de la phase G1
00:12:0104 à la phase S du cycle cellulaire,
00:12:0224 l'action de deux kinases,
00:12:0503 la kinase dépendante de la cycline en phase S,
00:12:0701 et la kinase dépendante de Dbf4, ou DDK,
00:12:1021 conduit à l'accumulation d'un certain nombre de protéines différentes
00:12:1328 sur l'hélicase réplicative chargée,
00:12:1628 parce que ce que je ne t'ai pas dit c'est que
00:12:1923 lors de son chargement initial
00:12:2114 il entoure l'ADN double brin
00:12:2311 et il est complètement inactif, d'accord ?
00:12:2526 Il est donc important qu'il soit inactif à ce stade
00:12:2720 et vous verrez pourquoi.
00:12:2828 Maintenant, ces protéines associées
00:12:3029 incluent deux protéines dont j'ai déjà parlé,
00:12:3315 Cdc45 et GINS,
00:12:3527 et ils se réunissent
00:12:3818 pour activer l'hélicase et
00:12:4104 forment l'hélicase réplicative active,
00:12:4223 le complexe CMG.
00:12:4404 Maintenant, l'ADN simple brin
00:12:4612 qui s'est formé à ce stade
00:12:4802 permet le recrutement du reste de la machinerie de synthèse d'ADN
00:12:5100 et assemblage d'une paire de réplisomes bidirectionnels.
00:12:5504 Maintenant, qu'est-ce qui est important dans ce processus
00:12:5629 est que l'étape de chargement de l'hélicase
00:12:5917 est séparé de l'étape d'activation de l'hélicase.
00:13:0220 Et c'est critique pour un
00:13:0427 attribut très important de la réplication de l'ADN eucaryote,
00:13:0727 c'est-à-dire que le génome est répliqué
00:13:1009 exactement une fois par cycle cellulaire.
00:13:1216 Vous ne voulez jamais qu'une origine initie
00:13:1424 plus d'une fois par cycle cellulaire.
00:13:1622 Donc, je veux parler de la façon dont la cellule s'assure que
00:13:1910 sur les deux prochaines diapositives.
00:13:2112 Donc, pendant la phase G1 du cycle cellulaire,
00:13:2313 il y a de faibles niveaux d'une enzyme
00:13:2619 appelée kinase dépendante de la cycline.
00:13:2819 C'est l'enzyme clé
00:13:3021 qui entraîne la progression du cycle cellulaire.
00:13:3203 Pendant G1, il n'y a que
00:13:3420 Kinases G1 dépendantes des cyclines
00:13:3607 -- pas de kinases dépendantes de la cycline en phase S --
00:13:3815 et en général leur activité est beaucoup plus faible.
00:13:4107 Dans ces conditions,
00:13:4318 vous pouvez assembler ou charger de nouvelles hélicases réplicatives
00:13:4619 aux origines de la réplication,
00:13:4800 mais vous ne pouvez pas les activer, car,
00:13:5005 comme je vous l'ai dit dans la diapositive précédente,
00:13:5122 vous avez besoin d'une activité CDK de phase S pour cela.
00:13:5522 Lorsque vous passez à la phase S du cycle cellulaire,
00:14:0001 CDK de phase S,
00:14:0128 et en fait les CDK en général,
00:14:0314 deviennent beaucoup plus représentés,
00:14:0523 activité beaucoup plus élevée,
00:14:0705 et ils ont deux conséquences.
00:14:0902 L'une est qu'ils
00:14:1217 déclencher l'initiation de toutes les hélicases chargées,
00:14:1518 comme je l'ai décrit dans la diapositive précédente.
00:14:1729 La deuxième conséquence importante
00:14:1927 est qu'ils ciblent également
00:14:2212 trois des quatre protéines
00:14:2421 impliqué dans le chargement de l'hélicase
00:14:2624 -- le complexe Mcm2-7, ORC et Cdc6 --
00:14:3113 et chacun de ces événements de phosphorylation
00:14:3327 inhibe le chargement de l'hélicase.
00:14:3606 Je vais décrire cela en détail dans un instant,
00:14:3813 mais laissez-moi d'abord expliquer la logique de ce système.
00:14:4121 Donc, vous pouvez voir que dans ce système
00:14:4329 il n'y a qu'une seule chance, pendant G1,
00:14:4525 pour charger une hélicase réplicative par cycle cellulaire,
00:14:4817 et il n'y a qu'une seule chance,
00:14:5014 pendant la phase S, typiquement,
00:14:5202 mais vraiment toute la période de S, G2 et M,
00:14:5426 où vous pourriez en fait activer une hélicase.
00:14:5700 En pratique, tout cela se produit pendant la phase S
00:15:0005 pour diverses raisons que je n'aborderai pas,
00:15:0227 mais ce que cela signifie est
00:15:0510, vous ne pouvez fondamentalement lancer la réplication qu'à partir d'une origine
00:15:0800 une fois par cycle cellulaire.
00:15:0928 Et ce système fonctionne plutôt que vous avez
00:15:1118 10 origines, 1000 origines ou 30000 origines.
00:15:1505 Cela fonctionnera tout aussi bien.
00:15:1704 Et il est donc très capable de s'adapter
00:15:1909 de nombreuses tailles de génomes différentes.
00:15:2110 Maintenant, vous vous demandez peut-être ce qui se passe
00:15:2313 aux transitions G1-S et M-G1.
00:15:2613 C'est vraiment une période dangereuse
00:15:2815 où vous voulez arrêter le chargement de l'hélicase
00:15:3100 avant de commencer l'activation de l'hélicase.
00:15:3226 S'il y a eu une transition progressive,
00:15:3428 vous pourriez avoir une brève période
00:15:3628 où les deux pourraient se produire en même temps,
00:15:3815 et cela pourrait permettre une réplication.
00:15:4111 Cependant, il s'avère que le cycle cellulaire
00:15:4316 a mis au point des mécanismes,
00:15:4525 et je ne vais pas les détailler,
00:15:4712 qui désactivent le chargement de l'hélicase
00:15:4914 avant d'activer l'activation de l'hélicase
00:15:5200 à la transition G1-S,
00:15:5325 et de la même manière vous désactivez l'activation
00:15:5613 avant d'activer le chargement de l'hélicase
00:15:5929 à la transition M-G1.
00:16:0113 Donc, à chacune de ces transitions clés,
00:16:0310 tu as une petite fenêtre
00:16:0526 où aucun d'eux ne peut se produire.
00:16:0729 D'accord ?
00:16:0927 Et je dois juste souligner que cette transition
00:16:1122 au M au G1
00:16:1322 est exactement là où se produit la division cellulaire,
00:16:1510 pour que vous puissiez maintenant recommencer le processus,
00:16:1817 parce que vous avez maintenant deux cellules,
00:16:2004 dont chacun a un complément complet
00:16:2213 du génome qu'il contient
00 : 16 : 2406 et est prêt à lancer un nouveau cycle
00:16:2626 de division cellulaire et donc de synthèse d'ADN.
00:16:3019 Maintenant, comment S CDK
00:16:3305 contrôler les protéines de chargement de l'hélicase ?
00:16:3501 Nous savons que le mieux dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae,
00:16:3724 où nous savons que, par exemple,
00:16:4006 les cyclines-CDK phosphorylent les protéines Mcm,
00:16:4305 ce qui les fait être
00:16:4517 exporté hors du noyau.
00:16:4700 Maintenant, cela peut être déroutant pour vous
00:16:4826 parce qu'évidemment il y a beaucoup de protéines Mcm
00: 16: 5128 qui sont chargés sur l'ADN
00:16:5315 que vous ne voulez pas quitter le noyau,
00:16:5513 et le point important ici est que
00:16:5703 uniquement les Mcm non associés à l'ADN
00:17:0011 sont exportés.
00:17:0203 Donc, dès qu'ils ont terminé leur fonction,
00:17:0316 ils sont exportés vers le cytoplasme,
00:17:0423 mais s'ils attendent à une origine, chargés,
00:17:0707 à activer,
00:17:0824 ils ne sont pas exportés par phosphorylation CDK.
00:17:1217 Cdc6 est également phosphorylé par CDK,
00:17:1604 et cette phosphorylation
00:17:1800 conduit à sa reconnaissance par un complexe protéique appelé SCF,
00:17:2124 qui est une ubiquitine ligase,
00:17:2322 qui cible Cdc6
00:17:2625 avec de multiples modifications de l'ubiquitine,
00:17:2818 qui à son tour provoque Cdc6
00:17:3127 pour être reconnu par le protéasome et dégradé.
00:17:3502 Donc, sauf en G1,
00:17:3620 Cdc6 est constamment dégradé
00:17:3810 et ne peut donc pas fonctionner.
00:17:4014 Enfin, ORC est également phosphorylé,
00:17:4222 et dans ce cas nous en savons moins à ce sujet,
00:17:4425 mais c'est prob.
00: 17: 4626 probablement un événement qui inhibe l'interaction de
00: 17: 5014 l'une des autres protéines de chargement d'hélicase
00:17:5206 avec ORC.
00:17:5401 D'accord.
00:17:5522 Donc, je vous ai parlé du règlement de cet événement,
00:17:5719 parlons de la façon dont cela se produit réellement.
00:18:0017 Donc, c'est juste une illustration des événements de chargement de l'hélicase.
00:18:0410 Nous savons que la première étape de ce processus
00:18:0622 est la reconnaissance de l'ADN d'origine
00:18:0820 par le complexe de reconnaissance d'origine,
00:18:1006 ou ce que j'appellerai ORC à partir de maintenant.
00:18:1225 ORC recrute alors Cdc6
00:18:1522 alors que les cellules entrent dans la phase G1 du cycle cellulaire,
00:18:1713 quand il est nouvellement synthétisé,
00:18:1913 puis le complexe ORC-Cdc6
00:18:2205 peut recruter un complexe entre l'hélicase Mcm2-7 et Cdt1.
00:18:2807 Et cela forme ce complexe initial
00:18:3005 appelé l'OCCM,
00:18:3129 pour ORC, Cdc6, Cdt1, complexe Mcm.
00:18:3422 Et je tiens à souligner qu'à ce stade,
00:18:3825 c'est l'extrémité C-terminale des complexes Mcm,
00:18:4022 ici,
00:18:4209 qui interagit avec ORC.
00:18:4401 L'anneau est toujours ouvert à ce stade,
00: 18: 4527 mais ils sont liés à des morceaux d'ADN adjacents,
00:18:4809 expliquant très clairement comment vous recrutez
00:18:5029 le premier Mcm à l'ADN.
00:18:5320 Maintenant, la prochaine étape après ça
00:18:5629 nécessite l'hydrolyse de l'ATP,
00:18:5817 et implique un certain nombre d'étapes
00:19:0015 dont je vais parler plus en détail
00:19:0215 dans ma deuxième partie de ma présentation.
00:19:0416 Mais le résultat final est que
00:19:0715 vous vous retrouvez avec un double hexamère de Mcms sur l'ADN,
00:19:1002 avec ensuite en interaction
00:19:1222 via leurs régions N-terminales
00:19:1424 pour former un double hexamère tête à tête
00:19:1706 des protéines sur l'ADN,
00:19:1818 et c'est vraiment le premier marqueur d'initiation bidirectionnelle,
00:19:2200 parce qu'ils sont maintenant prêts
00:19:2411 pour quitter l'origine dans des directions opposées.
00:19:2802 Donc, cela se produit pendant G1.
00:19:3029 Encore une fois, les hélicases sont inactives à ce stade,
00:19:3310 et ce qui se passe ensuite c'est toi
00:19:3527 transition en phase S
00:19:3807 et vous subissez l'activation de l'hélicase.
00:19:3921 Voici un aperçu de ce processus,
00:19:4121 et je vais d'abord passer en revue
00:19:4328 et ensuite je vais passer en revue les étapes en détail.
00:19:4615 Donc, le premier événement est.
00:19:4812 il nécessite la kinase DDK
00:19:5025 et cela aboutit au recrutement
00:19:5300 de l'un des deux activateurs,
00:19:5429 la protéine Cdc45.
00:19:5726 Ensuite, S-CDK peut agir
00:19:5928 et cela recrute l'autre activateur,
00:20:0219 le complexe GINS,
00:20:0411 ainsi que Pol ε et plusieurs autres protéines.
00:20:0717 À ce stade,
00:20:1024 vous avez deux CMG qui se sont formés sur le modèle,
00:20:1311 mais il est intéressant de noter qu'ils ne sont pas encore actifs.
00:20:1605 Cela nécessite l'activité d'une troisième protéine,
00:20:1816 la protéine Mcm10,
00: 20: 2026 pour déclencher réellement le déroulement de l'ADN
00:20:2228 et activation CMG.
00:20:2500 Et cela nécessite aussi l'association
00:20:2711 de la protéine de liaison simple brin eucaryote
00:20:3000 RPA.
00:20:3201 Enfin, une fois l'ADN simple brin formé,
00:20:3402 les ADN polymérases restantes,
00:20:3708 ainsi que d'autres protéines auxiliaires,
00:20:3908 sont recrutés pour former le réplisome.
00:20:4128 Maintenant, c'est beaucoup à regarder,
00: 20: 4409 donc je veux décomposer cela en étapes individuelles
00:20:4629 afin que vous puissiez comprendre comment cela se produit plus en détail.
00:20:5008 Alors, voici notre double hexamère chargé,
00:20:5218 et il est prêt à être activé,
00:20:5506 vient d'entrer dans la phase S.
00:20:5723 Donc, la première étape est la reconnaissance DDK
00:21:0020 de la région N-terminale
00:21:0219 de plusieurs des sous-unités Mcm.
00:21:0513 Il phosphoryle ces sous-unités
00:21:0716 et cela crée un site de liaison
00:21:0921 pour une deuxième protéine appelée Sld3,
00:21:1312 qui à son tour permet le recrutement
00:21:1510 d'une des deux protéines activatrices,
00:21:1801 Cdc45.
00:21:1918 Maintenant, j'ai montré ceci pour le bon hexamère,
00:21:2119 mais bien sûr, cela doit aussi se produire
00:21:2314 pour l'hexamère gauche également.
00:21:2606 Ok, maintenant nous avons le premier activateur présent,
00:21:3012 et c'est un événement DDK, ou dépendant de la kinase dépendant de Dbf4.
00:21:3311 La prochaine étape nécessite absolument
00:21:3617 la kinase dépendante de la cycline en phase S,
00:21:3810 et à quoi ça sert
00:21:4114 phosphoryler, premier, Sld3,
00:21:4405 et ensuite, deuxièmement, il phosphoryle.
00:21:4706 pas nécessairement dans cet ordre,
00:21:4825 mais il phosphoryle également Sld2.
00:21:5117 Maintenant, ces événements de phosphorylation
00:21:5308 provoquent le recrutement d'une variété de protéines supplémentaires.
00:21:5618 Plus particulièrement,
00:21:5824 Sld2 est reconnu par une protéine appelée Dpb11,
00:22:0116 et cela en utilisant une paire de motifs répétés BRCT,
00:22:0607 qui reconnaissent,
00:22:0800 d'une manière spécifique à la phosphorylation,
00:22:0916 un peptide sur Sld2.
00:22:1123 Cet événement de phosphorylation
00:22:1403 provoque également le recrutement de
00:22:1618 Pol ε et la protéine GINS
00:22:1904 dans un complexe plus grand
00:22:2120 c'est ce qu'on appelle le complexe de pré-atterrissage, ou pré-LC.
00:22:2519 Maintenant, ce complexe est recruté dans son ensemble
00:22:2900 aux inactifs,
00:22:3206 hélicase prête à être activée,
00:22:3424 en utilisant l'interaction de la protéine Dpb11
00:22:3820 avec une phosphorylation différente.
00:22:4100 peptide phosphorylé, d'accord ?
00:22:4317 Et ceci, encore une fois, est médié par
00:22:4603 une paire distincte de motifs BRCT,
00:22:4816 qui reconnaissent,
00:22:5017 d'une manière spécifique à la phosphorylation,
00:22:5206 peptides dans Sld3.
00:22:5423 Donc, à ce stade, nous avons recruté
00:22:5706 à la fois Cdc45 et GINS,
00:22:5908 et nous avons donc
00:23:0129 un complexe CMG présent,
00:23:0319 d'accord, mais ce n'est pas encore actif.
00:23:0503 Et bien sûr, nous devons également le faire
00:23:0727 pour l'autre hexamère.
00:23:0908 Ok, alors que se passe-t-il ensuite
00:23:1204 est vraiment un point d'investigation majeure sur le terrain,
00:23:1604 mais il y a un certain nombre de choses dont nous savons qu'elles doivent arriver.
00:23:1822 Donc, l'un d'eux est que
00:23:2021 plusieurs protéines quittent le réplisome.
00:23:2309 Cela inclut Sld2, Sld3 et Dpb11.
00:23:2720 Donc, nous avons notre complexe CMG,
00:23:2913 et c'est, encore une fois, l'hélicase réplicative active,
00:23:3204 mais il n'est pas encore actif
00:23:3329 parce que pour que le premier déroulement de l'ADN se produise
00:23:3728 la protéine Mcm10 doit agir.
00:23:4020 Et nous savons que cela en fait
00:23:4307 stimule directement l'activité de l'hélicase,
00:23:4512 et qu'il peut
00:23:4718 provoquent un certain nombre de changements
00:23:4921 afin de provoquer le déroulement initial.
00:23:5211 Exactement l'ordre de ces changements,
00:23:5515 et si Mcm10 ou des événements antérieurs peuvent les stimuler,
00:23:5803 est inconnu.
00:23:5912 Nous savons seulement que vous ne voyez pas d'ADN simple brin
00:24:0107 jusqu'à ce que Mcm10 arrive.
00:24:0325 Mais cette structure,
00:24:0528 qui a maintenant RPA
00:24:0814 se liant aux régions simple brin,
00:24:1001 a un certain nombre de changements dramatiques
00:24:1200 par rapport à la structure précédente.
00:24:1320 Alors, bien sûr, l'ADN d'origine
00:24:1509 a dû être fondu pour créer
00:24:1724 ADN simple brin.
00:24:1828 De plus, le brin non transloquant
00:24:2215 a dû être exporté depuis le canal central.
00:24:2603 Souvenez-vous, les Mcms étaient là
00:24:2804 ADN double brin initialement,
00:24:2916 cependant, après cette transition
00:24:3122 la bonne hélicase
00:24:3400 va avoir un seul brin présent,
00:24:3618 et l'hélicase gauche
00:24:3820 va avoir un seul brin différent.
00:24:4010 Donc, ça veut dire ces complexes Mcm
00:24:4210 doit ouvrir, éjecter un seul brin,
00:24:4422 puis refermer autour d'un autre.
00:24:4715 Et, enfin, vous vous souviendrez que
00:24:4922 les hélicases sont dans ce double hexamère serré, tête à tête, initialement,
00:24:5304 et ils doivent se séparer dans ce processus.
00:24:5504 Donc, je les ai listés dans un ordre,
00:24:5712 mais nous ne savons pas si c'est réellement l'ordre
00:24:5924 ils se produisent dans
00:25:0116 -- c'est un domaine d'investigation active.
00:25:0323 D'accord.
00:25:0519 Donc, à ce stade, nous savons que nous avons l'ADN simple brin
00:25:0722 nécessaire pour l'amorçage,
00:25:0918 et ce qui se passe, c'est que
00:25:1125 le reste de la machinerie de synthèse d'ADN est recruté.
00:25:1422 En particulier, Pol α-primase,
00:25:1623 est recruté par des interactions de
00:25:1921 Ctf4 avec le complexe GINS,
00:25:2316 et aussi avec Pol α.
00:25:2515 Cela permet la synthèse des premières amorces d'ARN
00:25:3007 puis l'extension de ces amorces par Pol α sous forme d'ADN.
00:25:3327 Ces amorces peuvent ensuite être reprises,
00:25:3612 soit par Pol δ soit par Pol ε,
00:25:3912 selon qu'ils sont en tête
00:25:4116 ou le brin en retard,
00:25:4300 et vous avez maintenant un réplisome actif.
00:25:4523 Donc, il y a beaucoup plus à comprendre
00:25:4902 à propos de ce processus
00:25:5021 -- c'est beaucoup moins bien compris
00:25:5214 quelle est l'architecture de ce complexe --
00:25:5407 et il y a beaucoup d'enquêtes en cours à ce stade
00:25:5703 pour comprendre cela.
00:25:5808 Par exemple, j'ai illustré Pol δ
00:26:0101 étant sur le site de réplication,
00:26:0226 mais de nombreuses preuves suggèrent que c'est en fait après.
00:26:0700 cela se produit en quelque sorte après le passage de la fourchette.
00:26:0824 Donc, il fait son travail,
00:26:1013 mais un peu séparément du travail
00:26:1216 du reste des polymérases.
00:26:1327 Je ferai également remarquer que je n'ai pas montré
00:26:1603 soit le chargeur à pince coulissante, RF-C,
00:26:1910 ou pinces coulissantes.
00:26:2018 Ils joueraient tous les deux, mais, encore une fois,
00:26:2211 ils ne font pas partie de la fourche de réplication réelle.
00:26:2420 Alors, j'espère que vous avez appris
00:26:2725 beaucoup sur le fonctionnement de la réplication, ici,
00:26:3013 et si tu restes à l'écoute je te le dirai
00:26:3218 beaucoup plus de détails
00:26:3511 sur la façon dont les hélicases se chargent,
00:26:3704 et ce que nous avons appris en utilisant
00:26:3821 biochimie d'une molécule unique
00:26:4016 pour enquêter sur ce processus.
00:26:4219 Je voudrais remercier Sera Thornton,
00:26:4419 qui a fait toutes les animations dans cette partie de ma présentation.
00:26:4714 Ceux-ci ont été effectués dans le cadre du développement
00:26:4928 d'un cours appelé 728x,
00:26:5124 qui est disponible sur
00:26:5416 les plateformes MITx et edX,
00:26:5618 et se concentre bien sûr sur la biologie moléculaire,
00:26:5910 pas seulement la réplication de l'ADN mais tout le dogme central.
00:27:0229 Je tiens également à remercier mes ressources financières,
00:27:0502 l'Institut médical Howard Hughes,
00:27:0628 ainsi que l'Institut national des sciences médicales générales.


ADN polymérase eucaryote α

Pol α et l'Hélicase

Les deux principaux moteurs moléculaires de la machinerie d'élongation de la réplication sont les ADN polymérases et l'hélicase. La coordination de ces deux activités sur les brins avant et arrière est importante pour la réplication simultanée des deux brins ainsi que pour la prévention d'une exposition excessive à un seul brin due au déroulement. De plus, le couplage de l'hélicase et de Pol α sur le brin discontinu assure le bon espacement et le bon timing pour le de novo synthèse d'amorces d'Okazaki. L'importance d'une association intime entre l'activité primase et hélicase est mieux illustrée chez les bactériophages et les procaryotes. Dans les bactériophages T7 et p4, la primase et l'hélicase sont codées dans un seul polypeptide. Dans Escherichia coli , la primase ( DnaG ) et l'hélicase (DnaB) interagissent pour former un complexe. Cette interaction stimule à la fois les activités primase et hélicase et détend la spécificité de séquence de DnaG, permettant à DnaG d'amorcer successivement la synthèse de fragments d'Okazaki pendant la synthèse de brins en retard. L'hélicase DnaB hexamérique forme une structure annulaire qui entoure le brin retardé 5 & x27 lors de sa translocation et de son déroulement, tandis que DnaG utilise l'ADN simple brin nouvellement exposé (ADNsb) comme matrice. La liaison topologique de l'hélicase à l'ADN améliore la processivité de l'hélicase et facilite la translocation de la primase vers les sites d'amorçage.

Chez les eucaryotes, l'hélicase MCM est considérée comme la principale hélicase réplicative. Comme l'ADNB, l'hélicase MCM est une enzyme hexamérique qui forme une structure en anneau, mais contrairement à l'ADNB, les six sous-unités ne sont pas identiques bien que hautement conservées. L'hélicase MCM est chargée sur l'ADN duplex sous la forme d'un double hexamère, encerclant l'ADN duplex, suggérant que le mécanisme de déroulement peut être différent de celui de l'ADNB. Il a été proposé que l'hélicase MCM puisse agir comme une translocase d'ADN double brin qui pompe l'ADN duplex dans le double hexamère d'une manière analogue à celle de l'antigène SV40 grand T ou de l'enzyme bactérienne de migration de branche de jonction RuvAB Holliday ( Figure 1 ). Dans ce scénario, la connexion de l'hélicase MCM qui est positionnée en avant de la fourche sur l'ADN duplex avec Pol α qui s'initie sur le simple brin déroulé doit reposer sur d'autres facteurs. En effet, aucune interaction directe entre Pol α et l'hélicase MCM n'a été observée. Un candidat pour la protéine de liaison est Mcm10 dans la levure bourgeonnante, qui est nécessaire à la fois pour l'initiation de la synthèse d'ADN à la transition de phase G1 à S et tout au long du processus d'élongation. Mcm10 interagit à la fois avec la Pol α et l'hélicase MCM et est nécessaire à la stabilité de la Pol α chez la levure bourgeonnante et les humains ( Figure 1 ). L'interaction entre les sous-unités de l'hélicase MCM et Mcm10 a été confirmée chez Xenopus, et l'interaction physique entre la Pol α humaine et Mcm10 a été déterminée par cristallographie. Chez les Xénopes et les humains, le facteur d'établissement de cohésion Ctf4/And1 interagit également avec Pol α. De plus, l'interaction avec RPA et Ctf4/And1 stimule l'activité primase et rend les enzymes plus processives.


Qu'est-ce qui est arrivé en premier ? L'ADN ou les ADN polymérases ? - La biologie

La PCR (réaction en chaîne par polymérase) est une technique dans laquelle des cycles de dénaturation, d'hybridation avec amorce et d'extension avec l'ADN polymérase sont utilisés pour amplifier le nombre de copies d'une séquence d'ADN cible de plus de 100 fois en quelques heures. Le biologiste moléculaire américain Kary Mullis a développé les techniques de PCR dans les années 1970. Pour son invention ingénieuse, il a reçu le prix Nobel 1993 en physiologie ou médecine.

L'amplification par PCR de l'ADN est comme n'importe quel Réplication de l'ADN par ADN polymérase in vivo. (dans les cellules vivantes) La différence est que la PCR produit de l'ADN dans un tube à essai. Pour qu'une réaction PCR se déroule, quatre composants sont nécessaires : matrice, amorce, désoxyribonecléotides (adénine, thymine, cytosine, guanine) et ADN polymérase. De plus, une partie de la séquence de l'ADN ciblé doit être connue afin de concevoir les amorces correspondantes. Dans la première étape, l'ADN double brin ciblé est chauffé à plus de 194°F (90°C) pour la dénaturation. Au cours de ce processus, deux brins de l'ADN ciblé sont séparés l'un de l'autre. Chaque brin est susceptible d'être un modèle. La deuxième étape est réalisée vers 122° (50°C). A cet abaissé Température, les deux amorces s'hybrident à leur séquence complémentaire sur chaque matrice. L'ADN polymérase étend ensuite l'amorce en utilisant les nucléotides fournis. En conséquence, à la fin de chaque cycle, le nombre de molécules d'ADN double.

La PCR a d'abord été réalisée manuellement dans des incubateurs de températures différentes pour chaque étape jusqu'à l'extraction de l'ADN polymérase à partir de thermophiles. bactéries. La bactérie Thermus aquatique a été trouvé dans le parc national de Yellow Stone. Cette bactérie vit dans les sources chaudes à 203°F (95°C). L'ADN polymérase de T. aquaticus maintient son activité au-dessus de 95°C pendant de nombreuses heures. Plusieurs ADN polymérases thermorésistantes supplémentaires ont également été identifiées.

Génétique Chauffer des ADN polymérases résistantes, qui ont des fonctions de relecture et font moins de mutations dans les produits d'ADN amplifiés, sont disponibles dans le commerce. Les réactions de PCR sont désormais réalisées dans différents thermocycleurs. Les thermocycleurs sont conçus pour changer les températures automatiquement. Les chercheurs règlent les températures et l'heure et, à la fin de la procédure, sortent le tube à essai de la machine.

L'invention de la PCR a été révolutionnaire pour biologie moléculaire. La PCR est précieuse pour les chercheurs car elle leur permet de multiplier la quantité d'une séquence d'ADN unique en une grande &mdashand donc exploitable&mdashamount en très peu de temps. Des chercheurs dans le Projet du génome humain utiliser la PCR pour rechercher des marqueurs dans des segments d'ADN clonés et pour commander des fragments d'ADN dans des bibliothèques. Les biologistes moléculaires utilisent la PCR pour cloner l'ADN. La PCR est également utilisée pour produire de la biotine ou d'autres sondes marquées chimiquement. Ces sondes sont utilisées dans acide nucléique hybridation, in situ hybridation et autres molécules la biologie procédures.

PCR, couplée à fluorescence techniques et informatiques, permet l'amplification en temps réel de l'ADN. Cela permet la détection quantitative de molécules d'ADN qui existent en quantités infimes. La PCR est également largement utilisée dans les tests cliniques. Aujourd'hui, la routine d'utiliser la PCR dans le diagnostic de maladies infectieuses telles sida et dans un certain nombre de tests médico-légaux.


Bases de cytosine non naturelles reconnues comme thymines par les ADN polymérases par la formation de la géométrie Watson-Crick

École des sciences de la vie, Département de biologie chimique et Centre de biomolécules synthétiques et fonctionnelles, Collège de chimie et d'ingénierie moléculaire et Centre des sciences de la vie de Pékin-Tsinghua, Université de Pékin, Pékin, 100871 Chine

Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale.

Institut de chimie théorique et computationnelle, Collège de chimie et d'ingénierie moléculaire et Centre d'innovation biomédicale pionnière, Université de Pékin, Pékin, 100871 Chine

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Résumé

L'émergence de bases d'ADN non naturelles offre des opportunités de démystifier les mécanismes par lesquels les ADN polymérases décodent fidèlement les informations chimiques sur la matrice. Il a été précédemment montré que deux bases cytosine non naturelles (appelées "M-fC" et "I-fC"), qui sont des adduits de marquage chimique de la base épigénétique 5-formylcytosine, peuvent induire une transition C-à-T lors de l'amplification de l'ADN. Cependant, la façon dont les ADN polymérases reconnaissent de telles bases cytosine non naturelles reste énigmatique. Ici, les structures cristallines de bases cytosine non naturelles appariées à dA/dG dans le système complexe KlenTaq polymérase-hôte-invité et appariées à dATP dans le site actif de la polymérase KlenTaq ont été déterminées. Les paires de bases M-fC et I-fC avec dA/dATP, mais pas avec dG, dans une géométrie Watson-Crick. Cette étude révèle que la formation de la géométrie Watson-Crick, qui peut être activée par la règle A, est importante pour la reconnaissance des cytosines non naturelles.

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ADN polymérases

Je. Caractéristiques générales.

Taq L'ADN Pol I est constitué de 832 acides aminés (Mr 94 000) ( 1 ). Les résidus N- et C-terminaux devraient être respectivement Met et Glu. L'enzyme ne contient pas de Cys.

Taq L'ADN Pol présente une homologie de séquence 50 % avec E. coli ADN Pol I dans les résidus C-terminaux ∼400 qui constituent le domaine de la polymérase. Taq Pol a une activité 5'-nucléase indépendante dans le domaine N-terminal (résidus 1-290) mais n'a pas d'activité 3′ → 5′-exonucléase.

Les structures cristallines de Taq Pol (69) et Klentaql (75) révèlent que le domaine de la polymérase C-terminale est identique en termes de pli à celui de Klenow Pol. Concernant le domaine 3′ → 5′-exonucléase (résidus 324–515) de Klenow Pol, Taq Pol est nettement différent en ayant des délétions de quatre boucles de longueurs 8 à 27 résidus. Les quatre résidus acides (D424, D501, D355, E357) connus pour être essentiels pour la liaison aux métaux divalents et la catalyse exonucléolytique dans Klenow Pol sont remplacés par des résidus incapables de lier les ions métalliques (L356, R405, G308, V310) dans le vestigial domaine 3′ → 5′-exonucléase de Taq Pol.

Le domaine 5′-nucléase N-terminal de Taq Pol a une fente profonde qui contient à sa base un groupe de résidus acides hautement conservés dans les domaines 5′-nucléases de la famille Pol I. Sept des groupes carboxylate sont présumés former trois sites de liaison aux métaux divalents (un triangle de 5 × -10 × ∼10 Å). Deux résidus (R25 et R74) sont essentiels pour l'activité 5'-nucléase.

Parmi les autres différences notables par rapport à Klenow Pol, Klentaql a 19 substitutions de charges opposées, suggérant une redistribution globale des charges qui est susceptible de jouer un rôle dans la thermostabilité.


Différence entre l'ADN polymérase 1 et 3

ADN polymérase 1 vs 3

Les ADN polymérases sont des enzymes spécialement conçues qui aident à la formation de molécules d'ADN en assemblant de minuscules blocs de construction d'ADN appelés nucléotides. L'ADN polymérase aide à diviser la molécule d'ADN en deux ADN identiques. Ce processus de division de l'ADN est appelé réplication de l'ADN. L'ADN polymérase agit comme un catalyseur dans la réplication de l'ADN et est donc très essentielle. L'ADN polymérase aide à lire les brins d'ADN déjà existants pour créer deux nouveaux brins qui correspondent à l'ADN existant d'origine. De cette façon, l'information génétique est transmise aux cellules filles et transmise d'une génération à l'autre.

Différence de structure

Il existe de nombreuses variétés d'ADN polymérases basées sur les différentes fonctions qu'elles doivent remplir. L'ADN polymérase 1 est essentielle à la réplication de l'ADN et est également appelée Pol 1. Elle a été découverte par Arthur Kornberg. L'ADN polymérase 3 est essentielle pour la réplication de l'ADN procaryote et a été découverte par Thomas Kornberg et Malcolm Gefter. L'ADN polymérase 3 est également appelée holoenzyme et c'est le composant le plus essentiel du réplisome.

Différence de fonction

Les fonctions de l'ADN polymérase 1 aident à la réplication de l'ADN. Il est utilisé pour la recherche en biologie moléculaire. Au cours du processus de réplication, une amorce d'ARN est remplie dans le brin retardé de l'ADN. L'ADN polymérase 1 supprime l'amorce d'ARN et remplit les nucléotides nécessaires à la formation de l'ADN dans le sens 5 'à 3'. Cela aide également à la relecture pour voir s'il y a une erreur lors de la réplication et lors de la correspondance des paires de bases. Le fait qu'il faut retenir est que cette ADN polymérase 1 ne fait qu'ajouter les nucléotides mais ne les joint pas. La jonction de l'ADN est effectuée par une autre enzyme appelée ligase qui forme des brins continus d'ADN. La fonction principale de l'ADN polymérase 1 est le marquage de l'ADN par translation de coupure et synthèse du second brin d'ADNc. L'ADN polymérase 1 catalyse également la synthèse 5' à 3' de l'ADN. L'ADN polymérase 1 lit la forme et la polarité du dNTP entrant. L'ADN polymérase 1 a 3 activités comme la polymérase, l'exonucléase 3' à 5' et l'exonucléase 5' à 3'. L'ADN polymérase 1 est une ADN polymérase dépendante de la matrice.

Le centre catalytique Pol 3 a des sous-unités étroitement liées appelées alpha, epsilon et thêta. La sous-unité alpha est responsable de l'activité de l'ADN polymérase, la sous-unité epsilon a une activité d'exonucléase de relecture et la sous-unité thêta est la plus petite de toutes et contribue à améliorer les propriétés de relecture d'epsilon. Un Replisome est situé au niveau de la fourche de réplication. L'ADN polymérase 3 est un composant du réplisome et aide donc à la réplication.

L'ADN polymérase 3 est essentielle pour la réplication des brins principaux et retardés, tandis que l'ADN polymérase 1 est essentielle pour éliminer les amorces d'ARN des fragments et les remplacer par les nucléotides requis. Ces enzymes ne peuvent pas se remplacer car les deux ont des fonctions différentes à remplir. Les ADN polymérases aident à transférer l'information génétique et les traits d'une génération à l'autre grâce au processus de réplication de l'ADN.