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On trouve des endonucléases de restriction dans ?

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Citation de : Scientific American juillet 1975 La manipulation des gènes par Stanley Cohen :

Les endonucléases de restriction (et les méthylases de modification) sont très répandues dans les micro-organismes ; gènes pour fabrication ils ont été trouvés sur chromosomes viraux et l'ADN plasmidique extrachromosomique ainsi que sur de nombreux chromosomes bactériens.

Pourquoi les gènes pour faire RE se trouveraient-ils sur les chromosomes viraux ? Aussi, pourriez-vous donner quelques exemples où ils se trouvent sur des plasmides ?


Il existe de nombreuses propositions sur le rôle écologique des systèmes de restriction-modification (RM), et pourquoi ils existeraient sur des éléments génétiques mobiles (par exemple, les plasmides et les virus). Dans ce cas, je parle spécifiquement des virus qui infectent les bactéries (alias bactériophage).

1) Les systèmes RM peuvent avoir une fonction antivirale. Normalement, nous penserions que de tels systèmes font partie du chromosome de l'hôte, mais comme l'a suggéré Alan Boyd, une fois qu'un phage tempéré s'est intégré dans le chromosome, son aptitude est liée à son hôte. Par conséquent, un système RM trouvé dans un prophage pourrait prévenir les infections par des phages supplémentaires. Voir ici pour une discussion sur ce problème : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23471617

2) Les systèmes RM peuvent avoir des propriétés "addictives" en agissant comme des systèmes toxine-antitoxine. Fondamentalement, cela signifie que si les gènes du système RM sont perdus, la cellule hôte meurt. Cela peut fournir une sélection pour le maintien des plasmides et du prophage à l'intérieur de la cellule hôte. Voir ici pour une discussion sur ce problème : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3874152/

3) Enfin, les virus doivent détruire le génome de l'hôte, à la fois pour supprimer toute réponse antivirale et pour libérer les nutriments nécessaires à la réplication virale. Bien que cela soit typiquement obtenu avec des nucléases autres que des endonucléases de restriction, il existe au moins une situation dans laquelle une RE semble être impliquée. Ceci est discuté dans le premier lien ci-dessus (voir la section intitulée « Rôle dans la nutrition »)


Si vous avez un génome à ADNdb et que vous le répliquez en tournant comme la plupart des bactériophages et de nombreux plasmides, une endonucléase est à peu près une nécessité.


L'enzyme de restriction familière EcoRI est codée par un plasmide.

Betlach et al. (1976) Une analyse par endonucléase de restriction du plasmide bactérien contrôlant la restriction EcoRI et la modification de l'ADN. Nourris. Proc. 35:2037 - 43.

Pour un exemple de système codé par phage, voir :

Dempsey et al. (2005) Sau421, un système de restriction-modification de type BcgI codé par le phage Phi42 à conversion quadruple de Staphylococcus aureus. Microbiologie 151 : 1301-1311

Ce deuxième article suggère une réponse à la raison pour laquelle un phage aurait un tel système : les lysogènes de Phi42 sont résistants à l'infection par les 23 membres d'un ensemble standard de S. aureus phage. Une fois qu'un phage s'est lysogénéisé, il est dans son intérêt d'empêcher la lyse de son hôte.


Système de modification des restrictions

Les système de modification des restrictions (Système RM) se trouve dans les bactéries et autres organismes procaryotes, et fournit une défense contre l'ADN étranger, tel que celui porté par les bactériophages.

Les bactéries possèdent des enzymes de restriction, également appelées endonucléases de restriction, qui clivent l'ADN double brin à des points spécifiques en fragments, qui sont ensuite dégradés davantage par d'autres endonucléases. Cela empêche l'infection en détruisant efficacement l'ADN étranger introduit par un agent infectieux (tel qu'un bactériophage). Environ un quart des bactéries connues possèdent des systèmes RM et parmi celles-ci, environ la moitié ont plus d'un type de système.

Comme les séquences reconnues par les enzymes de restriction sont très courtes, la bactérie elle-même en contiendra presque certainement au sein de son génome. Afin d'éviter la destruction de son propre ADN par les enzymes de restriction, des groupes méthyle sont ajoutés. Ces modifications ne doivent pas interférer avec l'appariement des bases de l'ADN et, par conséquent, seules quelques bases spécifiques sont généralement modifiées sur chaque brin.

Les endonucléases clivent les liaisons phosphodiester internes/non terminales. Ils ne le font qu'après avoir reconnu des séquences spécifiques dans l'ADN qui sont généralement longues de 4 à 6 paires de bases, et souvent palindromes.


Les endonucléases de restriction sont utilisées pour la synthèse d'ADN in vitro synthétisé par les bactéries dans le cadre de leur mécanisme de défense présent

Les endonucléases de restriction sont utilisées pour la synthèse d'ADN in vitro synthétisé par des bactéries dans le cadre de leur mécanisme de défense présent dans les cellules de mammifères pour la dégradation de l'ADN lorsque la cellule meurt utilisée en génie génétique pour ligaturer deux molécules d'ADN

Biotechnologie : Principes et processus

ré. Produit contre 143. La première thérapie génique clinique a été administrée en 1990 à une fillette de quatre ans souffrant de SCID. Le processus impliquait a. Transfert du gène ADA dans le sang b.Traitement par enzymothérapie substitutive c. Introduction d'ADAC-ADN fonctionnel (à l'aide d'un vecteur rétroviral) dans les lymphocytes du patient, qui sont ensuite retournés au patient d. Transfert du gène ADA via la méthode du vaccin ADN

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S 36. Quelle(s) enzyme(s) sera produite dans une cellule dans laquelle il y a une mutation non-sens dans le gène lac Y ? (1) Lactose perméase et transacétylase (2) ß-galactosidase (3) Lactose perméase (4) Transacétylase

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Lequel des ions suivants stimule la libération rapide d'électrons de l'eau ? (1) Mg++ (2) Chat+ (4) Mn++ (3) CH-


Restriction et modification de l'ADN

Diversité et évolution

Les enzymes R-M peuvent être disséquées en modules. Une MTase de type II comprend un TRD et un module chargé de catalyser le transfert du groupe méthyle d'AdoMet vers la position définie sur la base pertinente. Les domaines catalytiques partagent des similitudes de séquences, et celles-ci sont plus similaires lorsque la réaction catalytique est la même, c'est-à-dire qu'elle donne le même produit (par exemple, 5 mC). Compte tenu des spécificités correspondantes de l'ENase et de la MTase apparentées, on pourrait s'attendre à ce que leurs TRD soient de séquence d'acides aminés similaire. Ce n'est pas le cas, il semble probable que les deux enzymes utilisent des stratégies différentes pour reconnaître leur séquence cible. Chaque sous-unité de l'ENase dimère doit reconnaître une moitié de la séquence à symétrie de rotation alors que la MTase monomère doit reconnaître la séquence entière. L'absence de similitude entre les TRD de l'ENase et de sa MTase apparentée suggère qu'ils peuvent avoir évolué à partir d'origines différentes.

Les enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence cible sont appelées isoschizomères. On s'attend simplement à ce que les TRD de deux de ces enzymes soient très similaires. Ce n'est pas nécessairement le cas. De plus, les similitudes observées ne semblent pas corrélées à la distance taxonomique. Les séquences d'acides aminés des isoschizomères HaeIII et NgoPII, qui sont isolés de bactéries dans le même phylum, présentent peu ou pas de similitude alors que les isoschizomères FnuDI et NgoPII, qui sont isolés de bactéries dans différents phylums, sont très similaires (59% identité).

Les systèmes R-M de type I sont complexes dans leur composition et lourds dans leur mode d'action, mais ils sont bien adaptés à la diversification de la spécificité de séquence. Une seule sous-unité (HsdS ou S) confère une spécificité à l'ensemble du complexe R-M et au complexe supplémentaire plus petit qu'est une MTase. Tout changement de spécificité affecte la restriction et la modification de manière concomitante. Conformément à leur potentiel à développer de nouvelles spécificités, les systèmes de type I existent sous forme de familles au sein desquelles les membres, par exemple EcoKI et EcoBI, ne se distinguent que par leurs sous-unités S. Actuellement, des gènes alléliques ont été identifiés pour au moins sept membres d'une même famille, chaque membre ayant une spécificité différente. Il est plus surprenant de constater que les gènes alléliques dans E. coli, et ses proches, spécifient également au moins deux autres familles d'enzymes de type I. Alors que les membres d'une famille n'incluent que des différences de séquence majeures dans leurs polypeptides S, ceux de différentes familles partagent des identités de séquence très limitées (généralement 18 à 30 %). De toute évidence, les différences entre les séquences de gènes pour les systèmes R-M de type I ne sont pas une indication de la parenté phylogénétique des souches qui les codent. Il est intéressant de noter que malgré l'absence générale de similitudes de séquences entre les membres de différentes familles d'enzymes de type I, des similitudes prononcées ont été identifiées pour les TRD de différentes familles lorsqu'elles confèrent la même spécificité de séquence.

Les informations provenant des séquences de gènes pour les systèmes de type I et de type II, comme l'ont déclaré Raleigh et Brooks, en 1998, "donnent une image d'un pool de gènes qui ont circulé avec peu de limitations taxonomiques pendant très longtemps".

La variabilité allélique est l'une des caractéristiques les plus frappantes des systèmes R-M de type I. La nature bipartite et asymétrique de la séquence cible offre plus de possibilités de diversité de spécificité de séquence que les séquences de reconnaissance symétriques des systèmes de type II. La sous-unité S des enzymes de type I comprend deux TRD, chacune spécifiant un composant de la séquence cible. Cette organisation de domaines rend la sous-unité bien adaptée à la génération de nouvelles spécificités résultant soit de nouvelles combinaisons de TRD, soit de changements mineurs dans l'espacement entre les TRD. Dans le premier cas, la recombinaison ne fait que réassortir les régions spécifiant les TRD et, dans le second, un croisement inégal au sein d'une courte séquence dupliquée conduit à une modification de l'espacement entre les TRD. Ces deux processus se sont produits en laboratoire par hasard, ainsi que par conception. La protection des séquences cibles non modifiées dans le chromosome de l'hôte, par atténuation des restrictions, augmente la possibilité de changements de spécificité.

Alors que de nombreuses bactéries conservent la liaison étroite des trois gènes des systèmes R-M de type I (hsdR, hsdM, et hsdS Figure 2 ), un certain nombre de bactéries ont été décrites qui contiennent plusieurs copies de hsdS qui sont à phase variable. Le brassage des séquences d'ADN qui codent pour les TRD de différentes protéines HsdS fournit une méthode dynamique pour faire varier la spécificité. Dans Mycoplasma pulmonaire, il existe deux exemples de « shufflons », des systèmes qui se recombinent hsdS gènes. Les deux shufflons contiennent hsdR et hsdM gènes flanqués de deux hsdS gènes inversés les uns par rapport aux autres. La recombinaison entre ces deux exemplaires de hsdS peut générer quatre spécificités cibles différentes. Un shufflon plus complexe existe dans le génome du commensal humain Bacteroides fragilis, qui contient un hsd locus ayant la capacité de générer huit protéines HsdS avec des spécificités différentes.

Pour les systèmes R-M de type I, l'échange ou le repositionnement de domaines peut créer des enzymes avec de nouvelles spécificités, mais l'évolution de nouveaux TRD avec des spécificités différentes n'a pas été observée. Dans une expérience, une sélection forte pour un changement qui a permis une dégénérescence à l'une des sept positions dans la séquence cible n'a pas réussi à produire des mutants avec une spécificité relâchée.


11.1 : Endonucléases de restriction

  • Contribution de Clare M. O&rsquoConnor
  • Professeur agrégé émérite (biologie) au Boston College

Les systèmes de restriction/modification bactérienne protègent contre les envahisseurs

La découverte d'enzymes de restriction, ou endonucléases de restriction (RE), a été déterminante pour le développement du clonage moléculaire. Les ER se produisent naturellement dans les bactéries, où ils reconnaissent spécifiquement de courtes étendues de nucléotides dans l'ADN et catalysent les cassures double brin au niveau ou à proximité.
le site de reconnaissance (également appelé site de restriction). À ce jour, des milliers d'ER avec des spécificités distinctes ont été décrites. Vous vous demandez peut-être pourquoi les bactéries hébergent ces enzymes potentiellement destructrices. Les ER font partie d'un système de défense bactérien contre l'ADN étranger, tel qu'un bactériophage infectieux. Les sites RE dans l'ADN de la bactérie sont protégés du clivage car ils ont été modifiés par une méthyltransférase qui modifie spécifiquement les sites RE. Les activités combinées de l'endonucléase et de la méthyltransférase sont appelées système de restriction/modification. Aujourd'hui, la plupart des ER disponibles dans le commerce ne sont pas purifiés à partir de leurs sources naturelles. Au lieu de cela, les ER sont généralement isolés à partir de bactéries qui surexpriment de grandes quantités de ER à partir de plasmides. Ces ER recombinantes ont souvent été conçues par des biologistes moléculaires pour inclure des changements d'acides aminés qui augmentent l'activité catalytique ou la stabilité de l'ER.

Pour comprendre le fonctionnement des ER, nous utiliserons comme exemple EcoRI, l'une des ER les mieux étudiées. Bien que les noms des RE individuels puissent ressembler un peu à des paroles de bébé, la nomenclature est en fait très systématique et est basée sur sa source biologique. EcoRI se trouve naturellement dans la souche RY13 de Escherichia coli. Son nom commence par le genre et l'espèce (Eco pour E. coli), suivi d'un identifiant de souche (R pour RY13), et se termine par un chiffre romain qui distingue les différentes RE trouvées dans la souche. Souche RY13 de E. coli contient plusieurs ER, mais seulement EcoRI et EcoRV, sont largement utilisés en biologie moléculaire.

Les enzymes de restriction clivent des sites spécifiques dans l'ADN

Les enzymes de restriction comme EcoRI sont souvent appelées 6-cutters, car elles reconnaissent une séquence de 6 nucléotides. En supposant une distribution aléatoire de A, C, G et Ts dans l'ADN, la probabilité prédit qu'un site de reconnaissance pour un 6-cutter devrait se produire environ une fois pour chaque 4096 pb (4 6 ) dans l'ADN. Bien sûr, la distribution des nucléotides dans l'ADN n'est pas aléatoire, de sorte que les tailles réelles des fragments d'ADN produits par EcoRI varient de centaines à plusieurs milliers de paires de bases, mais la taille moyenne est proche de 4000 pb. Les fragments d'ADN de cette longueur sont utiles en laboratoire, car ils sont suffisamment longs pour contenir la séquence codante des protéines et sont bien résolus sur des gels d'agarose.

EcoRI reconnaît la séquence G A A T T C dans l'ADN double brin. Cette séquence de reconnaissance est un palindrome avec un axe de symétrie double, car la lecture de 5&rsquo à 3&rsquo sur chaque brin de l'hélice donne la même séquence. La nature palindromique du site de restriction est plus évidente dans la figure ci-dessous. Le point au centre du site de restriction indique l'axe de symétrie. EcoRI catalyse l'hydrolyse des liaisons phosphodiester entre G et A sur les deux brins d'ADN. Les fragments de restriction générés dans la réaction ont de courtes queues simple brin aux extrémités 5&rsquo. Ces extrémités sont souvent appelées « extrémités collantes », en raison de leur capacité à former des liaisons hydrogène avec des séquences d'ADN complémentaires.

Les RE sont parfois appelés ciseaux moléculaires en raison de leur capacité à générer des fragments de restriction qui se terminent par des séquences définies. Ces "extrémités collantes" sont importantes pour la technologie de l'ADN recombinant, car elles permettent aux chercheurs de construire des molécules d'ADN de conception. Deux molécules d'ADN avec des extrémités collantes compatibles peuvent être réunies par des ADN ligases qui servent de &ldquopaste&rdquo en rescellant les liaisons phosphodiester rompues. Nous ne générerons pas de molécules recombinantes dans cette classe, mais il est important de comprendre leur importance pour la biologie moderne. Considérons les plasmides pBG1805 et pYES2.1. À partir des cartes de plasmides du chapitre 10, vous pouvez voir que ces plasmides complexes ont été construits en assemblant des séquences d'ADN provenant de sources évolutives distinctes.


Introduction

Les enzymes de restriction sont également appelées "ciseaux moléculaires" car elles clivent l'ADN au niveau ou à proximité de séquences de reconnaissance spécifiques connues sous le nom de sites de restriction. Ces enzymes font une incision sur chacun des deux brins d'ADN et sont également appelées endonucléases de restriction. 4

Les virus infectent les cellules hôtes en injectant leur ADN dans les cellules. Cet ADN viral détourne la machinerie de la cellule hôte pour la reproduction de la descendance virale, entraînant la mort de la cellule hôte. Pour vaincre l'infection virale, de nombreuses bactéries et archées ont développé plusieurs mécanismes. Un mécanisme de protection majeur implique l'utilisation d'enzymes de restriction pour dégrader l'ADN viral envahissant en le clivant au niveau de sites de restriction spécifiques. Dans le même temps, la cellule hôte protège son propre ADN contre le clivage en utilisant d'autres enzymes appelées méthylases, qui méthylent les bases d'adénine ou de cytosine dans les séquences de reconnaissance de l'hôte. Pour chacune des enzymes de restriction, la cellule hôte produit une méthylase correspondante qui méthyle et protège l'ADN hôte de la dégradation. Ces enzymes constituent les systèmes de restriction-modification (R-M).

Les enzymes de restriction catalysent l'hydrolyse de la liaison entre l'atome d'oxygène 3' et l'atome de phosphore dans le squelette phosphodiester de l'ADN. Les enzymes ont besoin de Mg 2+ ou d'autres ions divalents pour leur activité.


Fonction d'enzyme de restriction

La fonction des enzymes de restriction dans le monde naturel est de défendre les bactéries contre des virus spécifiques appelés bactériophages. Ces virus attaquent les bactéries en injectant de l'ARN ou de l'ADN viral dans un plasmide bactérien (petit anneau violet sur l'image ci-dessous) et en s'y répliquent. Si de l'ARN ou de l'ADN viral est détecté dans une cellule procaryote, cette cellule peut souvent arrêter le processus de réplication en coupant l'information génétique étrangère. Cela le rend inutile. Dans le même temps, l'ADN bactérien est protégé de l'action coupante de ses endonucléases de restriction au sein de ses sites de restriction. Ce mécanisme ajoute du méthyle (H3C) se groupe à la cytosine et à l'adénine de l'ADN bactérien sans affecter la séquence d'ADN codée.

A ce jour, environ 3500 enzymes de restriction ont été isolées à partir de plasmides bactériens. Chaque enzyme reconnaît une séquence spécifique du code génétique viral et essaiera de séparer le nouveau brin d'ADN muté à proximité ou plus loin du site de reconnaissance. Ce mécanisme de séparation naturel est également appelé digestion par les enzymes de restriction.

Non seulement l'emplacement et la méthode, mais aussi le type de coupe peuvent différer. Certains RE laissent des extrémités collantes inégales (extrémités non émoussées) entre des zones légèrement différentes d'un double brin qui surplombent d'autres laissent des extrémités émoussées où les paires de bases sont séparées au même point. Par exemple, BamHI est une enzyme de restriction de type II obtenue à partir de Escherichia coli qui reconnaît la séquence nucléotidique GGATCC et clive ces sections d'ADN en laissant des extrémités cohésives. Le clivage, comme le clivage d'une bûche avec une hache, est le terme scientifiquement accepté pour couper un brin d'ADN.

Dans l'image ci-dessous, une enzyme de restriction appelée HindIII clive l'ADN à différents endroits sur les deux brins pour former une extrémité collante.


Histoire des enzymes de restriction

Au début des années 1950, plusieurs équipes de recherche ont observé des différences dans l'efficacité de l'infection bactériophage sur différentes souches hôtes bactériennes de la même espèce [2,3]. Ceci a été décrit par Grasso et Paigen : Lorsque le phage λ s'est propagé dans une souche de bactéries (par exemple, E. coli C) a été utilisé pour infecter une autre souche de la même espèce de bactérie (par exemple, E. coli K), une diminution marquée du taux d'infection a été notée par rapport à la réinfection de la souche hôte (E. coli C). Le nouvel hôte (E. coli K) semblait sélectionner contre ou "restreindre" le phage entrant. Les chercheurs ont également noté qu'il ne s'agissait pas d'un phénomène héréditaire, car le phage qui s'est développé sur la nouvelle souche pourrait infecter cette souche à des taux plus typiques après un cycle d'infection. Le phénomène observé a été défini comme une « variation du contrôle de l'hôte » et est devenu un domaine de recherche intense pour découvrir les mécanismes sous-jacents [4].

Ce n'est que dans les années 1960 que les mécanismes sous-jacents à la variation du contrôle de l'hôte ont été déterminés comme impliquant le clivage enzymatique de l'ADN du phage, ce qui a conduit à la découverte et à l'isolement d'enzymes de restriction. Au début des années 1960, Werner Arber a observé que le déterminant de la gamme d'hôtes résidait sur l'ADN du phage, et des expériences ultérieures ont montré que la méthionine était impliquée dans la protection de l'hôte [5]. Ces découvertes ont finalement conduit à la proposition d'un système de restriction-modification (RM), dans lequel une enzyme de restriction et une méthylase de l'hôte travaillent ensemble pour cliver l'ADN viral étranger (non méthylé) tout en maintenant l'ADN de l'hôte protégé par méthylation [6 ].

Fait intéressant, la plupart des premiers travaux sur les systèmes R-M concernaient les groupes d'enzymes de restriction de type I et III, classés en fonction des aspects de leur structure et de leur fonction (voir Classification des enzymes de restriction). Cependant, l'utilité complète des enzymes de restriction n'est devenue apparente que lorsque Kent Wilcox et Hamilton Smith ont découvert HindII, la première enzyme de restriction de la classe de type II [7]. HindII reconnaît une séquence d'ADN symétrique spécifique et se clive d'une manière définie au sein de cette séquence de reconnaissance. Cette caractéristique, trouvée dans la plupart des premières enzymes de restriction de type II, a conduit Kathleen Danna et Daniel Nathans à utiliser HindII dans la cartographie physique de l'ADN du virus simien 40 [8], un processus connu sous le nom de cartographie des enzymes de restriction.

Pour leur travail de pionnier avec les enzymes de restriction, Daniel Nathans, Hamilton Smith et Werner Arber ont reçu le prix Nobel 1978 de physiologie ou médecine. Avec la découverte de l'ADN ligase, en combinaison avec la famille croissante des enzymes de restriction de coupe spécifiques au site, la technologie de l'ADN recombinant est née.


Méthylation

La méthylation de l'ADN est l'un des types de modification de l'ADN les plus courants chez les eucaryotes et les procaryotes. Chez les bactéries, il fait partie du système de défense par restriction-modification (R-M) contre l'infection par les phages (voir Bases des enzymes de restriction), par lequel les bactéries hôtes protègent leur propre ADN contre le clivage par leurs enzymes de restriction endogènes. La méthylation se produit généralement au niveau des bases cytosine (C) et adénine (A) et forme principalement des dérivés de la 5-méthylcytosine ( m 5C), de la N 4 -méthylcytosine ( m 4C) et de la N 6 -méthyladénine ( m 6A).

Les ADN méthyltransférases entraînent la réaction de méthylation en transférant un groupe méthyle d'un donneur aux bases acceptrices (par exemple, A et C). Les types les plus courants d'ADN méthyltransférases trouvés dans les souches de bactéries de laboratoire comprennent :

  • Endiguer: signifie éoxyunedenosine méthyltransférase et convertit la séquence 5′-GATC-3′ en 5′-G( m 6A)TC-3′
  • Dcm: signifie éoxycytosine méthyltransférase et convertit la séquence 5′-CCWGG-3′ en 5′-C( m 5C)WGG-3′ (où W est A ou T)
  • EcoKI: représente le système Type I R-M dans le E. coli K12 et modifie les adénosines dans la séquence 5'-AAC(N)6GTGC-3′
  • EcoBI: signifie le système Type I R-M dans le E. coli B et modifie les adénosines dans la séquence 5'-TGA(N)8TGCT-3′

Dans les systèmes mammifères et végétaux, la méthylation CpG ou CpNpG est une modification courante de l'ADN avec des implications dans les processus biologiques, ce qui en fait un axe majeur des études épigénétiques.

La sensibilité des enzymes de restriction vis-à-vis des sites de reconnaissance d'ADN méthylé dépend des enzymes de restriction. Par exemple, comme illustré dans Figure 4, La méthylation de Dam à GATC bloque complètement MboI mais active DpnI. D'autre part, la méthylation de CpG en 5'-CCGG-3' bloque l'activité de HpaII mais n'a aucun effet sur MspI. Dans certains cas, l'activité des enzymes de restriction n'est que partiellement inhibée par la méthylation (par exemple, Xhol).

Figure 4. Sensibilité variable des enzymes de restriction vis-à-vis de la méthylation de l'ADN du substrat.

Lors de la propagation de plasmides dans des bactéries, les effets de la méthylation sur les enzymes de restriction d'intérêt doivent être pris en compte. Pour empêcher la méthylation à 5′-GATC-3′ et 5′-CCWGG-3′, des cellules compétentes dépourvues de méthylases Dam et Dcm (endiguer – /dcm – ) doit être choisi pour la transformation du plasmide. Plus E. coli les cellules ne possèdent pas de système de méthylation CpG, donc la méthylation CpG n'est pas un problème pour l'ADN isolé des bactéries. Si l'ADN génomique est extrait de plantes et de mammifères, la méthylation peut se produire au niveau des sites CpG et avoir un impact sur la digestion par restriction directe par certaines enzymes sensibles à la méthylation.


Types de système de restriction et de modification (R-M) :

Enzymes de type I :- Les enzymes de restriction de type I présentent à la fois des activités de restriction et de modification de l'ADN. Elles nécessitent des cofacteurs tels que les ions Mg2+, la S-adénosylméthionine (SAM) et l'ATP pour leur activité. Les séquences de reconnaissance sont assez longues sans caractéristiques reconnaissables telles que la symétrie. Les endonucléases de restriction de type I clive l'ADN à des sites non spécifiques et qui peuvent être à 1000 paires de bases ou plus de la séquence de reconnaissance. Cependant, étant donné que la réaction de méthylation est effectuée par la même enzyme qui médie le clivage, l'ADN cible peut être modifié avant d'être coupé. En raison de ces caractéristiques, les systèmes de type I sont de peu de valeur pour la manipulation génétique.

Enzymes de type II :- Les enzymes de type II et leurs méthyltransférases de modification correspondantes agissent comme des protéines séparées. Ils présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux systèmes de type I et III. Premièrement, la restriction et la modification sont médiées par des enzymes distinctes, il est donc possible de cliver l'ADN en l'absence de modification. Deuxièmement, les activités de restriction ne nécessitent pas de cofacteurs tels que l'ATP ou la S-adénosylméthionine, ce qui les rend plus faciles à utiliser. Ils ne nécessitent que des ions Mg2+ comme cofacteurs. Ces enzymes sont spécifiques d'un site car elles hydrolysent des liaisons phosphodiester spécifiques dans les deux brins d'ADN. Les endonucléases de restriction de classe II sont généralement utilisées comme matériau clé dans les techniques de biologie moléculaire et d'ADN recombinant, y compris la cartographie du génome, l'analyse RFLP, le séquençage de l'ADN et le clonage.

Enzymes de type III :- Comme les enzymes de classe I, les enzymes de type III possèdent à la fois des activités de restriction et de modification. Elles reconnaissent des séquences spécifiques et clivent 25 à 27 paires de bases en dehors de la séquence de reconnaissance, dans une direction 3´. Ils ont besoin d'ions Mg2+ pour leur activité.

Enzymes de type II, ont des cofacteurs et une structure macromoléculaire similaires à ceux des systèmes de type II, le fait que la restriction se produise à distance du site de reconnaissance limite leur utilité.


Endonucléases de restriction de type II - une perspective historique et plus

Cet article poursuit la série d'enquêtes et de résumés sur les endonucléases de restriction (REases) commencée cette année dans Nucleic Acids Research. Nous discutons ici des REases de « Type II », le type utilisé pour l'analyse et le clonage de l'ADN. Nous nous concentrons sur leur biochimie : ce qu'ils sont, ce qu'ils font et comment ils le font. Les REases de type II sont produites par les procaryotes pour combattre les bactériophages. Avec une extrême précision, chacun reconnaît une séquence particulière dans l'ADN double brin et se clive à une position fixe à l'intérieur ou à proximité. Les découvertes de ces enzymes dans les années 1970, et des utilisations auxquelles elles pouvaient être faites, ont depuis impacté tous les recoins des sciences de la vie. Ils sont devenus les outils habilitants de la biologie moléculaire, de la génétique et de la biotechnologie, et ont fait des analyses aux niveaux les plus fondamentaux une routine. Des centaines de REases différentes ont été découvertes et sont disponibles dans le commerce. Leurs gènes ont été clonés, séquencés et surexprimés. La plupart ont été caractérisés dans une certaine mesure, mais peu ont été étudiés en profondeur. Nous décrivons ici les découvertes originales dans ce domaine et les propriétés des premières REases de type II étudiées. Nous discutons des mécanismes de reconnaissance de séquence et de catalyse, et des divers modes oligomères dans lesquels agissent les REases de type II. Nous décrivons l'hétérogénéité surprenante révélée par les comparaisons de leurs séquences et structures.

© The Author(s) 2014. Publié par Oxford University Press au nom de Nucleic Acids Research.

Les figures

Nombre de publications pour EcoRI…

Nombre de publications pour EcoRI et EcoRV par an de 1972 à 2012.…

Hamilton Smith et Daniel Nathans…

Hamilton Smith et Daniel Nathans lors de la conférence de presse du prix Nobel, le 12 octobre…

Illustration schématique des étapes…

Illustration schématique des étapes impliquées dans la reconnaissance et le clivage de l'ADN par les REases…

Structures co-cristallines de restriction spécifique…

Structures co-cristallines de complexes enzyme de restriction-ADN spécifiques déterminées entre 1990 et 1999.

Représentation schématique de l'interaction…

Représentation schématique de l'interaction d'EcoRI avec sa séquence de reconnaissance. Pour plus de clarté,…

Représentation schématique de l'interaction…

Représentation schématique de l'interaction d'EcoRV avec sa séquence de reconnaissance. Interactions avec…

Un mécanisme général pour l'ADN…

Un mécanisme général pour le clivage de l'ADN par EcoRI et EcoRV. Une eau activée…

Le site actif (PD…D/ExK) de…

Le site actif (PD…D/ExK) d'EcoRI et d'EcoRV.

Un exemple de site catalytique REase (Mval, pdb : 2OAA). L'eau nucléophile…

Mécanismes alternatifs de transfert de phosphoryle…

Mécanismes alternatifs des réactions de transfert de phosphoryle : associatif (en haut) et dissociatif (en bas). Les mécanismes…

Comparaison des sites actifs…

Comparaison des sites actifs de deux enzymes de restriction structurellement très similaires BglII…

La composition et le clivage de la sous-unité…

La composition des sous-unités et le mécanisme de clivage de certains sous-types de REases de type II.…

Mode de liaison à l'ADN par les protéines à doigt de zinc : chaque doigt reconnaît environ trois…


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