Informations

6.3 : Auxotrophes et milieux sélectifs - Biologie

6.3 : Auxotrophes et milieux sélectifs - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Les rencontré les mutants sont des auxotrophes Met, ce qui signifie qu'ils sont incapables de se développer dans des milieux qui ne contiennent pas Met. Par exemple, parce que la souche BY4742 porte des mutations dans le HIS3, LEU2, LYS2 et URA3 gènes, la souche ne poussera que dans des milieux contenant de l'histidine, de la leucine, de la lysine et de l'uracile. Les plasmides utilisés pour la transformation portent des allèles fonctionnels d'un gène défectif dans la souche hôte, permettant de sélectionner des transformants par leur capacité à croître sur des milieux dépourvus du nutriment essentiel.

Les milieux synthétiques sont un outil essentiel pour la culture et l'étude des auxotrophes, car tous les composants sont définis. Les chercheurs sur les levures ont développé une variété de formulations différentes pour les milieux synthétiques. Tous les milieux synthétiques contiennent une source de carbone (généralement du D-glucose), une source d'azote et des vitamines et minéraux essentiels. Les vitamines et les minéraux sont généralement achetés
dans une formulation connue sous le nom de base azotée de levure (YNB). Les suppléments ajoutés aux milieux synthétiques peuvent être adaptés pour soutenir ou sélectionner contre la croissance de génotypes particuliers. Dans ce cours, nous utiliserons le milieu Yeast Complete (YC) qui soutient la croissance de la plupart des S. cerevisiaesouches. Le taux de croissance des souches de type sauvage dans YC est un peu plus lent que celui dans les milieux riches comme YPD, mais les souches sont viables pendant de longues périodes. Le tableau de la page suivante montre la composition de YC, qui comprend un riche apport d'acides aminés et de bases nucléotidiques. En plus du support YC complet, nous utiliserons également des supports sélectifs dans lesquels certains composants ont été omis. Par exemple, dans ce laboratoire, nous utiliserons le support « drop-out » YC-Met, qui contient tous les composants YC du tableau suivant, à l'exception de la méthionine.

*YNB est un mélange complexe de vitamines, minéraux et sels. Concentrations finales en YC : Vitamines (μg/litre) : biotine (2), pantothénate de calcium (400), acide folique (2), inositol (2000), niacine (400), acide p-aminobenzoïque (200), chlorhydrate de pyridoxine (400), riboflavine (200), chlorhydrate de thiamine (400 ).
Minéraux (μg/litre) : acide borique (500), sulfate de cuivre (40), iodure de potassium (100), chlorure ferrique (200), sulfate de manganèse (400), molybdate de sodium (200), sulfate de zinc (400).
Sels (mg/litre): phosphate de potassium monobasique (1000), sulfate de magnésium (500), chlorure de sodium (100), chlorure de calcium (100).
(Source : labs.fhcrc.org/gottschling/Ye...tocols/yc.html)


Introduction aux médias de levure

Les levures sont des micro-organismes eucaryotes dont les génomes ont été largement étudiés et certains ont été séquencés. Ils sont relativement faciles à cultiver dans des conditions de laboratoire. De plus, malgré la petite taille de leur génome, ils présentent des caractéristiques et des processus cellulaires hautement conservés chez la plupart des eucaryotes. Par exemple, ils ont des organites liés à la membrane, un cytosquelette, un ADN nucléaire et des mécanismes de transcription similaires à ceux trouvés chez les eucaryotes supérieurs. De plus, les levures possèdent de nombreuses protéines sécrétoires et phéromones bien caractérisées. Plusieurs gènes de levure impliqués dans le traitement et la sécrétion de la protéase ont également été identifiés. Ainsi, les levures peuvent être utilisées pour plusieurs études de gènes et de protéines eucaryotes à l'aide d'outils de biologie moléculaire adaptés. Certaines applications pour les cultures de levure comprennent la synthèse de systèmes d'expression de protéines, l'étude de fonctions spécifiques de gènes ou de protéines et l'analyse de nouvelles interactions protéiques. Ils sont également utilisés pour de nombreuses applications industrielles telles que la fermentation, la cuisson et la bioremédiation.

Les milieux de culture de levure jouent un rôle important dans le soutien de la croissance à des fins à petite et à grande échelle. Typiquement, un milieu de culture de levure comprend de la peptone, un extrait de levure et du dextrose ou du glucose. Même de légères différences dans la composition des milieux peuvent donner des levures avec des caractéristiques de croissance distinctes.


Auxotrophes générés par Cas9 de Phaeodactylum tricornutum sont caractérisés par des délétions petites et grandes qui peuvent être complétées par des gènes plasmidiques

La diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum est un candidat attractif pour les applications de biologie synthétique. Développement de souches auxotrophes de P. tricornutum fournirait des marqueurs sélectifs alternatifs aux gènes de résistance aux antibiotiques couramment utilisés. Ici, en utilisant CRISPR/Cas9, nous montrons une édition réussie des gènes dans les voies de biosynthèse de l'uracile, de l'histidine et du tryptophane. Les événements d'édition sont caractérisés par une perte d'hétérozygotie et par l'apparition de grandes délétions allant jusqu'à

2,7-ko centré sur le site d'édition. Les phénotypes nécessitant de l'uracile et de l'histidine peuvent être complétés par des copies à base de plasmide des gènes intacts après durcissement du plasmide d'édition Cas9. La croissance d'auxotrophes d'uracile sur des supports complétés avec du 5-FOA et de l'uracile entraîne la perte du plasmide complémentaire, fournissant une méthode facile pour le durcissement des plasmides avec des applications potentielles dans l'ingénierie des souches et l'édition CRISPR. La caractérisation métabolique des auxotrophes de l'uracile a révélé des changements dans les concentrations d'orotate cellulaire compatibles avec une perte partielle ou complète de l'activité de l'orotate phosphoribosyl transférase dans les souches knock-out. Nos résultats élargissent la gamme de P. tricornutum souches auxotrophes et démontrent que les marqueurs de complémentation auxotrophes offrent une alternative viable aux marqueurs de sélection d'antibiotiques traditionnellement utilisés. Les marqueurs auxotrophes à base de plasmides devraient élargir la gamme des applications d'ingénierie du génome et fournir un moyen de bioconfinement des P. tricornutum souches.


Résultats

Identification de cibles Cas9 dans les gènes des voies de biosynthèse

Nous avons examiné les prédictions KEGG 23,24 basées sur la séquence du génome de P. tricornutum identifier les gènes dans les voies de biosynthèse de l'uracile et de l'histidine pour l'édition de Cas9. Nous nous sommes concentrés sur ces deux voies comme l'auxotrophie de l'uracile et de l'histidine, et les stratégies de contre-sélection sont couramment utilisées dans d'autres organismes modèles. Cette approche a identifié le gène PtUMPS bifonctionnel précédemment décrit qui devrait catalyser deux étapes de la voie de l'uracile : la conversion de l'orotate en orotidine monophosphate (OMP) et la conversion de l'OMP en uridine monophosphate (UMP) (Fig. 1A, Fig. supplémentaire .S1) 22 . Des protéines qui sont des orthologues d'enzymes caractérisées impliquées dans la biosynthèse de l'histidine ont également été identifiées (figure 2A, figure supplémentaire S2). Le gène PHATR_3140, ci-après appelé PtPRA-PH/CH, code pour une protéine bifonctionnelle prédite qui partage une similarité de séquence avec la protéine bactérienne HisIE et son homologue végétal HISN2 25,26. Ces protéines possèdent deux domaines fonctionnels homologues aux enzymes phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase (PRA-PH) et phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase (PRA-CH), respectivement. PRA-PH et PRA-CH, seuls ou en tant que protéine bifonctionnelle, devraient catalyser deux étapes successives qui se produisent tôt dans la voie de biosynthèse de l'histidine (Fig. 2A, Fig. supplémentaire S2). Le gène PtIGPS codant pour l'imidazole glycérol phosphate synthase (un homologue HIS3) s'est avéré être un gène dupliqué dans le P. tricornutum l'assemblage du génome et n'est donc pas prioritaire en tant que cible Cas9.

Nous avons également identifié le gène PtI3GPS-PRAI comme cible potentielle car il code une enzyme bifonctionnelle prédite qui est une fusion d'indole-3-glycérol-phosphate synthase (I3GPS) et de phosphoribosylanthranilate isomérase (PRAI), et catalyserait deux étapes successives dans la voie de biosynthèse du tryptophane (Fig. supplémentaire S3).

Knockouts générés par CRISPR dans les prévisions P. tricornutum voie de biosynthèse de l'uracile. (UNE) Une partie de la prévision P. tricornutum voie de biosynthèse pour la conversion de l'acide carbonique en uracile et uridine triphosphate, avec l'enzyme PtUMPS surlignée en bleu. L'inhibiteur compétitif, l'acide 5-fluoroorotique (5-FOA), est indiqué dans un cadre en pointillés à l'endroit où il pénètre dans la voie. Les noms abrégés des molécules et des enzymes sont indiqués entre parenthèses, et le P. tricornutum les noms de gènes sont indiqués entre crochets. (B) Exemple d'image du test d'édition T7EI pour cribler les exconjugants pour les événements d'édition potentiels dans le gène PtUMPS. Le substrat indique des fragments de gène PtUMPS amplifiés par la PCR, tandis que le produit T7 indique des exconjugants avec des preuves d'édition Cas9. WT, type sauvage P. tricornutum ADN génomique utilisé dans le test d'édition T7EI. M, échelle de 100 pb avec tailles indiquées en paires de bases (pb). Cette image a été recadrée à partir d'une image plus grande (Fig. supplémentaire S10). (C) Exemple de criblage phénotypique d'une souche knock-out de PtUMPS ( (Delta) UMPS2) étalée sur L1 seule ou L1 supplémentée en uracile à la dilution indiquée de concentration initiale. () Exemple de criblage de la perte du plasmide d'édition Cas9 résistant à la zéocine dans une souche knockout (Delta) UMPS2 par placage sur L1 supplémenté en uracile ou L1 supplémenté en uracile et zéocine. (E) Traces de séquençage Sanger des knockouts PtUMPS caractérisés avec la position (sous le tracé) et le type d'insertion ou de délétion (au-dessus du tracé) indiqués pour chaque allèle des trois souches. (F) Carte graphique de la position et de l'étendue des indels pour chacun des trois knockouts PtUMPS par rapport au gène UMPS de type sauvage (montré en haut). Les rectangles rouges indiquent les suppressions de nucléotides, les triangles verts indiquent les insertions de nucléotides, les rectangles jaune et bleu sur le gène WT indiquent la position des sites actifs PtUMPS (orotate phosphoribosyl transférase et orotidine-5'-phosphate décarboxylase), et les rectangles blancs avec des lignes pointillées représentent les introns.

Pour confirmer les sites cibles génomiques, nous avons amplifié et séquencé par PCR les gènes PtUMPS et PtPRA-PH/CH de la P. tricornutum Souche CCAP 1055/1 utilisée dans notre laboratoire. Deux allèles distincts pour les gènes PtUMPS et PtPRA-PH/CH ont été identifiés. Sept polymorphismes mononucléotidiques (SNP) dans les allèles PtUMPS entraînent des substitutions d'acides aminés qui différencient les deux allèles l'un de l'autre et des P. tricornutum génome (tableau supplémentaire S1). Toutes les substitutions sont situées dans des régions non conservées de la protéine PtUMPS (Fig. supplémentaire S4). De même, une mutation A à G à la position de base 1205 dans l'allèle 2 du gène PtPRA-PH/CH a été identifiée (tableau supplémentaire S1). Cette transversion convertit un glutamate hautement conservé en une glycine dans le site catalytique du domaine PRA-PH. L'impact de ces substitutions sur la fonction PtUMPS et PtPRA-PH/CH est inconnu.

Knockouts générés par CRISPR dans les prévisions P. tricornutum voie de biosynthèse de l'histidine. (UNE) Une partie de la voie de biosynthèse prévue pour la conversion du ribose-5-phosphate en l-histidine, avec l'enzyme bifonctionnelle PtPRA-PH/CH surlignée en bleu. Les noms abrégés de chaque enzyme sont indiqués entre parenthèses, et le P. tricornutum les noms de gènes sont indiqués entre crochets. (B) Exemple d'image du test d'édition T7EI pour cribler les exconjugants pour les événements d'édition potentiels dans le gène PtPRA-PH/CH. Le substrat indique des fragments de gène PtPRA-PH/CH amplifiés par la PCR, tandis que le produit T7 indique des exconjugants avec preuve d'édition Cas9. WT, type sauvage P. tricornutum ADN génomique utilisé dans le test d'édition T7EI. M, échelle de 1 ko avec tailles indiquées en paires de bases (pb). Cette image a été recadrée à partir d'une image plus grande (Fig. supplémentaire S11). (C) Exemple de criblage phénotypique d'une souche knock-out PtPRA-PH/CH ( (Delta) PtPRAPHCH1) transformée avec ou sans le plasmide complémentant PRA-PH/CH (pPtPRAPHCH) sur milieu solide L1 seul ou L1 supplémenté en histidine au dilution indiquée de la concentration initiale. WT, type sauvage P. tricornutum souche. () Traces de séquençage Sanger des knockouts PtPRA-PH/CH caractérisés avec la position (sous le tracé) et le type d'insertion ou de suppression (au-dessus du tracé) indiqués pour chaque allèle. (E) Carte graphique de la position et de l'étendue des indels pour le knock-out PtPRA-PH/CH par rapport au gène PtPRA-PH/CH de type sauvage (montré en haut). Les rectangles rouges indiquent les suppressions de nucléotides, tandis que les rectangles jaune et bleu sur le gène WT indiquent la position des sites actifs PRA-PH et PRA-CH.

L'édition Cas9 et TevCas9 des gènes auxotrophes est caractérisée par une perte d'hétérozygotie

Pour générer des knock-outs dans les gènes biosynthétiques de l'uracile et de l'histidine, nous avons conçu et cloné individuellement les ARN guide unique Cas9 et TevCas9 (sgRNA) contre différents sites dans les gènes PtUMPS, PtPRA-PH/CH et PtI3GPS-PRAI (tableau 1, figure supplémentaire S5 –S7). La nucléase TevCas9 est une nucléase double qui génère une délétion de 33 à 38 paires de bases entre les sites de coupure I-TevI ​​(Tev) et Cas9 27 . Les exigences de ciblage pour une nucléase TevCas9 sont un motif de clivage I-TevI ​​5 (^prime) -CNNNG-3 (^prime) positionné (sim) 15-18 paires de bases en amont du 5 (^prime) extrémité du site de liaison sgRNA. Les plasmides d'édition Cas9 ou TevCas9 ont été déplacés dans P. tricornutum par conjugaison bactérienne et exconjugants sélectionnés sur des milieux contenant de la zéocine.

Nous avons d'abord évalué l'édition par criblage P. tricornutum exconjugants par des tests de clivage de mésappariement de l'endonucléase I (T7EI) de T7 sur des produits de PCR amplifiés à partir de chaque gène cible (figures 1B, 2B, tableau 1). Ce test a identifié 6 sgRNA avec des taux d'édition détectables basés sur le criblage des exconjugants. Les colonies qui ont montré une édition ont été diluées, étalées pour obtenir des sous-clones, puis criblées pour le phénotype auxotrophe correspondant sur des milieux solides avec et sans supplément auxotrophe (uracile ou histidine) (Figs. 1C, 2C). Pour guérir les plasmides d'édition Cas9, des souches knock-out ont été cultivées sans sélection de zéocine pendant 1 semaine, et des dilutions ont été étalées pour obtenir des colonies uniques. Les colonies ont été striées sur des plaques L1 avec et sans zéocine pour cribler la perte de plasmide. Une image représentative démontrant la sensibilité à la zéocine due à la perte du plasmide d'édition Cas9 est montrée sur la figure 1D. Pour le knock-out du gène PtUMPS, nous avons en outre caractérisé 3 sous-clones avec un phénotype nécessitant de l'uracile pour déterminer si les knock-out étaient monoalléliques ou bialléliques. Parce que les deux allèles PtUMPS de P. tricornutum possédaient des SNP les uns par rapport aux autres, nous avons pu cartographier les événements d'édition spécifiques aux allèles (Fig. 1E, F). Deux des souches, (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2, étaient bialléliques et présentaient une perte d'hétérozygotie avec un allèle possédant une petite délétion (< 20 bps) et l'autre allèle possédant une grande délétion (> 610 pb). Le troisième sous-clone caractérisé, (Delta) UMPS3, était monoallélique et possédait une insertion homozygote de 1 pb. Pour les knock-outs PtPRA-PH/CH qui ont généré un phénotype nécessitant de l'histidine (Fig. 2B, C), le séquençage ciblé d'un sous-clone a révélé un génotype biallélique avec une délétion de 11 pb dans un allèle et une délétion de 6 pb dans le second allèle (Fig. 2D, E).

Suppressions importantes en édition P. tricornutum gènes métaboliques capturés par séquençage d'amplicons Nanopore. Pour chaque (UNEE), le nom du gène cible ainsi que l'enzyme d'édition sont indiqués. Les le plus à gauche le graphique montre la couverture de lecture normalisée moyennée sur une fenêtre de 5 pb pour l'échantillon édité (points noirs) et l'échantillon de type sauvage (points orange) par rapport à la position dans l'amplicon PCR. La numérotation sur l'axe des x est relative au codon d'initiation ATG pour chaque gène, la séquence en amont étant indiquée par un symbole moins (-) et la séquence en aval indiquée par un symbole plus (+). La ligne verticale verte indique le site de clivage Cas9 ou TevCas9, tandis que le rectangle ombré indique l'ORF. Les milieu plot est un diagramme de densité des suppressions > 50-bp. Les le plus à droite le graphique montre la longueur et la position des suppressions > 50 pb par rapport à leur position dans l'amplicon PCR, avec la numérotation de l'axe des x comme dans le le plus à gauche panneau. Chaque ligne horizontale indique un événement de suppression mappé. Les suppressions sont classées de la plus longue à la plus petite. La ligne verte indique le site de clivage Cas9 ou TevCas9.

Les types de suppressions observées dans les auxotrophes uracile et histidine sont compatibles avec des événements d'édition hétérogènes entraînant une perte d'hétérozygotie 28,29,30. Pour étendre ces observations, nous avons utilisé le séquençage Nanopore pour mieux évaluer le spectre des suppressions importantes qui sont souvent négligées dans les études d'édition Cas9. En plus des deux ARNsg qui ont montré une édition robuste sur le gène PtUMPS, nous avons examiné les événements de délétion dans les exconjugants avec des ARNsg ciblés sur le gène PtUREASE 6 et le gène PtI3GPS-PRAI. Pour chaque expérience, (sim) 1 000 exconjugants ont été regroupés et un produit de PCR (sim) 6 kb généré pour chacun des gènes cibles avec les sites cibles Cas9 ou TevCas9 prédits au milieu de l'amplicon. Nous avons concentré notre attention sur les suppressions > 50 pb car ces suppressions sont généralement sous-déclarées dans le séquençage d'amplicons ciblé. Nous avons noté une baisse de la couverture de lecture Nanopore centrée autour des sites cibles sgRNA prédits pour les produits amplifiés à partir des expériences d'édition Cas9 et TevCas9 (points noirs) par rapport à la couverture de lecture pour les expériences de contrôle (points orange), conformément à l'édition sur ces sites (Fig. 3, la gauche panneaux). La cartographie des points de début et de fin de la suppression a révélé que la plupart des suppressions étaient centrées sur le site cible Cas9 ou TevCas9 (Fig. 3, droit panels), avec des délétions allant jusqu'à 2700 pb (Fig. 3, centre panneau). La longueur de délétion moyenne pour les événements d'édition examinés par séquençage Nanopore et > 50 pb était de 1735 ± 719 pb pour Cas9 et de 2006 ± 633 pb pour TevCas9.

Collectivement, ces données montrent que l'édition Cas9 ou TevCas9 des gènes biosynthétiques peut facilement générer P. tricornutum auxotrophes identifiables par criblage phénotypique ou génétique. De plus, nos données concordent avec un nombre croissant de preuves révélant que l'édition Cas9 (et l'édition TevCas9 ici) génère des suppressions importantes qui seraient généralement manquées à moins que les stratégies de dépistage ne soient explicitement conçues pour rechercher une perte d'hétérozygotie.

Caractérisation phénotypique et métabolomique des knock-outs PtUMPS. (UNE) Essais de placage spot de souches de type sauvage (WT), (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 sur milieu solide L1 seul, L1 supplémenté en uracile, L1 supplémenté en 5-FOA, ou L1 supplémenté avec les deux l'uracile et le 5-FOA. Les dilutions indiquées sont relatives à la concentration initiale. (B) Courbes de croissance liquide des souches de type sauvage (WT), (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 dans des milieux liquides L1 seuls, ou supplémentés avec de l'uracile ou du 5-FOA ou les deux. Les points de données sont la moyenne de trois répliques indépendantes, avec des barres d'erreur représentant l'erreur standard de la moyenne. (C) Les concentrations d'orotate ont été mesurées par LC-MS à partir de cultures cultivées avec et sans supplémentation en uracile. Les barres représentent les valeurs moyennes et les barres d'erreur représentent l'écart type pour trois répétitions biologiques. Les points de données individuels sont représentés par des points colorés. Le niveau de confiance statistique a été calculé par un test t unilatéral. p < 0,001 est indiqué par un astérisque. () Graphique à barres montrant le pourcentage de rétention de plasmide dans les souches (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 hébergeant diverses constructions PtUMPS après 14 jours d'excroissance. Les barres représentent le rapport moyen des colonies sur des plaques sélectives L1 + nourséothricine par rapport à des plaques L1 non sélectives provenant de trois réplicats indépendants, les barres d'erreur représentant l'erreur standard de la moyenne.

Caractérisation phénotypique et métabolomique des knock-outs PtUMPS

Deux auxotrophes nécessitant de l'uracile ( (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2) ont été sélectionnés pour une caractérisation plus poussée par un premier placage sur milieu L1 avec et sans uracile et 5-FOA (Fig. 4A). Les souches knock-out PtUMPS n'ont pu survivre qu'en présence d'une supplémentation en uracile. De plus, les knock-out ont survécu à des concentrations de 5-FOA qui ont complètement inhibé la croissance de type sauvage P. tricornutum (Fig. 4A). Ceci est cohérent avec les phénotypes précédemment observés pour P. tricornutum UMPS KO 7,22 . Il y avait un léger avantage de croissance de (Delta) UMPS1 par rapport à (Delta) UMPS2 sur des milieux supplémentés à la fois avec du 5-FOA et de l'uracile, mais pas sur des milieux contenant de l'uracile seul. Pour comparer si les phénotypes observés étaient cohérents dans les milieux solides et liquides, nous avons surveillé la croissance de ces souches sur 10 jours dans des milieux liquides (Fig. 4B) et avons constaté que les taux de croissance étaient cohérents avec ceux observés sur les milieux solides, avec un notable différence (figures supplémentaires S8, S9, tableau supplémentaire S3). L'avantage de croissance de (Delta) UMPS1 sur (Delta) UMPS2 observé sur des milieux solides supplémentés à la fois de 5-FOA et d'uracile n'a pas été répliqué dans les milieux liquides car les temps de génération pour (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 étaient très similaires ( (sim) 24 et (sim) 22 h, respectivement).

Pour étudier l'impact des knock-outs de PtUMPS sur le métabolisme de l'uracile, nous avons effectué une métabolomique ciblée sur l'orotate de substrat UMPS en utilisant la LC-MS dans des souches de type sauvage et knock-out (Fig. 4C). Nous nous sommes concentrés sur la caractérisation de l'intermédiaire orotate dans la voie de l'uracile (Figs. 2A, 4C) en prédisant qu'il devrait y avoir une augmentation de l'orotate dans les souches knock-out par rapport au type sauvage. Nous n'avons pas pu détecter l'orotate dans la souche (Delta) UMPS1 en l'absence de supplémentation en uracile (-uracile), ou dans la souche (Delta) UMPS2 en condition -uracile ou +uracile. Une multiplication par six des taux d'orotate cellulaire a été observée dans la souche de type sauvage lorsque le milieu L1 était supplémenté en uracile (+uracile) par rapport au milieu L1 minimal (-uracile) (Fig. 4C). Fait intéressant, lorsque la souche (Delta) UMPS1 a été cultivée avec une supplémentation en uracile, nous avons détecté de l'orotate à des niveaux similaires à ceux observés dans la souche de type sauvage cultivée avec de l'uracile. Ce résultat suggère que l'allèle 1 dans la souche knockout (Delta) UMPS1 (avec une délétion dans le cadre de 18 pb) conserve une activité UMPS qui se comporte de manière similaire à la souche de type sauvage. En revanche, la souche (Delta) UMPS2 a deux délétions hors cadre qui abolissent probablement l'activité ODC et OPRT. Nous supposons que des niveaux indétectables d'orotate dans la souche (Delta) UMPS2 peuvent être dus au fait qu'elle est détournée vers une autre voie de biosynthèse.

Complémentation plasmidique des auxotrophes uracile et histidine

Complémentation à base de plasmides de P. tricornutum auxotrophes validerait que l'événement d'édition Cas9 était la cause du phénotype auxotrophe, tout en fournissant des alternatives aux méthodes de sélection basées sur les antibiotiques pour maintenir les vecteurs épisomiques. Nous avons d'abord examiné la complémentation du phénotype nécessitant de l'uracile en clonant à la fois les versions d'ADNg et d'ADNc de chaque allèle PtUMPS avec le promoteur natif et le terminateur dans le plasmide d'expression pPtGE31 résistant à la nourséothricine 6 . Ces plasmides ont été désignés pPtUMPSA1, pPtUMPSA2, pPtUMPScA1 et pPtUMPScA2 (tableau supplémentaire S3) et déplacés dans les souches (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 par conjugaison. Les exconjugants ont été plaqués sur des milieux solides L1 avec et sans supplémentation en uracile et 5-FOA (Fig. 4A). Toutes les souches complémentées se sont développées sur un milieu L1 minimal, contrairement aux knock-outs non complémentés, confirmant l'expression du gène UMPS à partir du plasmide pPtGE31. Aucune souche n'a poussé sur 5-FOA seul. De manière inattendue, certaines des souches complémentées ont survécu sur des plaques supplémentées à la fois de 5-FOA et d'uracile. Par exemple, lorsque (Delta) UMPS2 a été transformé avec l'un ou l'autre des plasmides de complémentation de l'allèle 1 (pPtUMPSA1 et pPtUMPScA1), une résistance claire au 5-FOA en présence d'uracile a été observée. Les phénotypes observés sur les milieux solides étaient cohérents avec ceux observés lorsque les souches étaient cultivées dans des milieux liquides avec une supplémentation similaire en milieu (Figs. supplémentaires S8, S9).

Le phénotype de croissance des souches (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 dans des milieux supplémentés en uracile et 5-FOA pourrait s'expliquer par une contre-sélection contre le plasmide portant un gène PtUMPS intact qui métaboliserait 5- FOA à un intermédiaire toxique. Nous avons ainsi testé la perte de plasmide dans les souches complémentées en étalant les souches (Delta) UMPS1 et (Delta) UMPS2 portant des plasmides d'expression différents sur L1 solide avec et sans nourséothricine après 14 jours de croissance. Comme le montre la figure 4D, la rétention plasmidique, telle que mesurée par le rapport des colonies sur L1 plus nourseothricin par rapport aux plaques L1, a été sévèrement réduite dans toutes les souches, allant de (sim) 1 à (sim) 33% . Cette observation pourrait expliquer pourquoi des colonies sont facilement apparues sur des milieux L1 supplémentés de 5-FOA et d'uracile et suggèrent que la guérison des plasmides portant le gène PtUMPS à partir de souches knock-out de PtUMPS est une simple question de croissance sur les milieux appropriés.

De même, nous avons pu compléter le phénotype nécessitant de l'histidine en clonant une copie de type sauvage du gène PtPRA-PH/CH dans un vecteur d'expression et en transformant le plasmide dans la souche (Delta) PRAPHCH1 par conjugaison. La souche (Delta) PRAPHCH1 avec le plasmide de complémentation s'est développée sur les deux milieux L1 solides avec et sans supplémentation en histidine, tandis que la souche (Delta) PRAPHCH1 sans le plasmide de complémentation n'a grandi que sur les milieux L1 avec supplémentation en histidine (Fig. 2C).


Protocole

1. Préparez un espace de travail sûr et stérile

Familiarisez-vous avec toutes les règles de laboratoire et les précautions de sécurité à prendre lorsque vous travaillez avec des micro-organismes. Indépendamment de la classification des risques biologiques, tous les matériaux qui entrent en contact avec des micro-organismes sont considérés comme des déchets infectieux et doivent être décontaminés avant d'être éliminés. Suivez les directives de sécurité conformément à celles fournies par les services institutionnels de santé et de sécurité environnementales, en mettant en place des poubelles appropriées pour l'élimination immédiate et appropriée des matériaux potentiellement contaminés (risques biologiques).

Stérilisez tous les instruments, solutions et milieux avant de les utiliser pour les procédures de placage.

Débarrassez-vous de tous les matériaux qui encombrent votre zone de travail sur la paillasse du laboratoire.

Nettoyer la zone de travail avec un désinfectant pour minimiser la contamination possible.

Installez un bec Bunsen et travaillez lentement, soigneusement et délibérément dans la zone de champ stérile créée par le courant ascendant de la flamme.

Si vous travaillez avec des organismes BSL-2, installez votre espace de travail dans une armoire de biosécurité. Un bec Bunsen ne peut pas être utilisé à l'intérieur de l'armoire car la chaleur de la flamme perturbe le flux d'air essentiel à son fonctionnement.

Disposer toutes les fournitures nécessaires à la procédure sur la paillasse du laboratoire à proximité du champ stérile. Assurez-vous que tous les matériaux sont correctement étiquetés. L'organisation de la zone de travail pour maximiser l'efficacité du travail et éviter les mouvements inutiles minimisera le temps d'exposition des matériaux expérimentaux aux contaminants en suspension dans l'air.

Placez le bec Bunsen à votre droite sur le banc.

Placez des plaques de gélose ou des boîtes de Pétri à votre gauche.

Disposez les cultures cellulaires, les tubes, les flacons et les bouteilles au centre de la paillasse.

Desserrez les bouchons des tubes, flacons et flacons afin qu'ils puissent être facilement ouverts d'une seule main lors des manipulations ultérieures.

Lavez-vous soigneusement les mains avec du savon antiseptique et de l'eau tiède avant de manipuler des micro-organismes.

2. Procédure de la plaque à stries : isolement des colonies bactériennes à l'aide de la méthode des quadrants

La procédure de strie-plate est conçue pour isoler des cultures pures de bactéries, ou colonies, à partir de populations mixtes par simple séparation mécanique. Les colonies uniques sont composées de millions de cellules poussant en grappe sur ou dans une plaque de gélose (Figure 1). Une colonie, contrairement à une seule cellule, est visible à l'œil nu. En théorie, toutes les cellules d'une colonie sont dérivées d'une seule bactérie initialement déposée sur la plaque et sont donc appelées clone, ou groupe de cellules génétiquement identiques.

Les bactéries existent dans une variété de formes et de tailles. Par exemple, l'individu Escherichia coli les cellules sont en forme de tige avec une longueur moyenne de 2 μm et une largeur de 0,5 μm tandis que Streptocoque les cellules sont sphériques avec un diamètre moyen de 1 μm. Certaines bactéries (comme E. coli) existent sous forme de cellules individuelles tandis que d'autres forment des modèles d'association distincts. Streptocoque, par exemple, poussent par paires ou forment des chaînes ou des amas de cellules. On suppose généralement qu'une seule colonie provient d'une seule cellule subissant une fission binaire, cependant, cette hypothèse n'est pas vraie pour les bactéries qui existent naturellement sous forme de paires, de chaînes ou d'amas ou qui se divisent par d'autres mécanismes. Alternativement, si trop de bactéries sont étalées, un chevauchement des cellules peut se produire et augmenter la probabilité que deux bactéries ou plus donnent naissance à ce qui semble être une seule colonie. Pour éviter ces complications lors de la description ou du dénombrement des cultures bactériennes poussant sur un milieu solide, les colonies sont appelées unités formant colonie (ufc).

Avec la procédure de la plaque à stries, un mélange de cellules est étalé sur la surface d'un milieu nutritif à base d'agar semi-solide dans une boîte de Pétri de telle sorte que de moins en moins de cellules bactériennes se déposent à des points largement séparés sur la surface du milieu et, après incubation, se développent en colonies. La méthode quadrant pour isoler des colonies uniques à partir d'un mélange de cellules sera décrite ici.

Le placage de stries peut être réalisé avec un certain nombre d'instruments différents (Figure 2). Une boucle métallique peut être réutilisée plusieurs fois et est utilisée pour le placage de souches de laboratoire de routine. Des boucles en plastique jetables sont disponibles dans le commerce et sont plus couramment utilisées lorsque l'on travaille avec des souches BSL-2 dans une armoire de biosécurité. De nombreux chercheurs préfèrent utiliser des bâtonnets de bois jetables et pré-stérilisés ou des cure-dents plats pour le placage de stries. Il s'agit d'une alternative peu coûteuse aux boucles en plastique jetables et peuvent être particulièrement utiles lorsque vous travaillez avec un échantillon environnemental tel que le sol qui contient probablement des bactéries formant des spores.

Les bâtonnets et cure-dents pré-stérilisés jetables n'ont pas besoin d'être flambés avec le bec Bunsen, empêchant ainsi l'aérosolisation inutile des bactéries sporulantes et la contamination croisée des surfaces de laboratoire ou des plaques de gélose avec des spores.

Étiquette autour du bord du fond (pas le couvercle) d'une plaque de gélose avec au moins votre nom, la date, le type de milieu de croissance et le type d'organisme à étaler sur le milieu.

Les plaques doivent être complètement sèches sans condensation sur le couvercle et préchauffées à température ambiante avant le placage par stries. Si les plaques sont conservées à 4 ଌ, retirez-les plusieurs heures voire la veille. Étalez-les en petites piles décalées de 2 à 3 assiettes maximum et laissez-les sécher.

L'échantillon à partir duquel la plaque à stries sera inoculée pourrait être soit une suspension de cellules dans un bouillon, soit une colonie existante provenant d'une autre plaque de gélose. Pour commencer, il est recommandé de n'utiliser qu'un seul échantillon pour ensemencer une seule plaque. Pour économiser du temps et du matériel, une seule plaque peut être utilisée pour plusieurs échantillons, mais seulement une fois que vous maîtrisez l'étalement d'un échantillon sur une plaque.

Pour le premier quadrant, l'échantillon est prélevé et étalé sur environ un quart de la surface du milieu à l'aide d'un mouvement de va-et-vient rapide et régulier (Panneau A de figure 3). Soulevez la moitié inférieure d'une plaque inversée du banc. Déplacez la boucle, le bâton ou le cure-dent plusieurs fois sur la surface de la gélose, du bord au centre de la plaque.

Si l'inoculum est une suspension cellulaire, obtenir une anse avec une anse métallique ou 5 à 10 μl avec une micropipette. Assurez-vous de faire tourbillonner ou de vortexer la suspension cellulaire avant de retirer une aliquote pour le placage. Utilisez une technique aseptique lors de l'exécution de cette étape, en enflammant non seulement l'anse mais aussi le bord de la bouteille ou du tube avant et après avoir retiré l'inoculum. De plus, ne touchez pas les côtés du tube ou du flacon avec la boucle ou le corps de la micropipette. Si vous pipez l'inoculum, distribuez la suspension cellulaire à l'endroit approprié de la plaque, puis utilisez une boucle, un bâton ou un cure-dent pour l'étaler sur le premier quadrant de la plaque.

Si l'inoculum est une colonie d'une autre plaque, touchez doucement la colonie avec la boucle, le bâton ou le cure-dent puis étalez-la sur le premier quadrant de la plaque. Assurez-vous que la boucle métallique est refroidie avant de toucher la colonie. Pour vous assurer que la boucle n'est pas trop chaude, touchez-la légèrement sur la plaque de gélose dans une zone désignée où aucune traînée ne se produira. Seules quelques cellules sont nécessaires de la colonie, pas la colonie entière.

Si vous utilisez une boucle métallique, flambez-la à l'aide d'un bec Bunsen avant d'obtenir l'inoculum pour la plaque (Panneau B de figure 3). Commencez à environ 3-4 pouces de la boucle, avec le fil dans la pointe du cône bleu, la partie la plus chaude de la flamme. Le métal doit devenir rouge chaud. Déplacez le fil pour que la flamme s'approche de la boucle. Cette manipulation évite l'aérosolisation des bactéries laissées sur la boucle par l'utilisation précédente.

La flamme tue les bactéries (mais pas les spores) et les courants de convection de l'air chauffé empêchent d'autres contaminants en suspension dans l'air de se déposer sur le fil métallique lors des manipulations ultérieures.

Si vous utilisez un cure-dent plat stérile, tenez doucement l'extrémité étroite entre le pouce et l'annulaire à un angle de 10 à 20 ° par rapport au milieu, et utilisez l'extrémité large pour rayer les quadrants. Si vous utilisez une boucle ou un bâton en bois, tenez-le comme un crayon sous le même angle. N'appuyez pas si fort que la boucle, le bâton ou le cure-dent s'enfonce dans la gélose.

Après avoir terminé le premier quadrant, retournez et remettez la plaque dans le couvercle sur le banc. Jetez le bâton ou le cure-dent ou reflammez la boucle métallique comme décrit à l'étape 4.

Tournez la boîte de Pétri à 90 ° pour rayer le deuxième quadrant. Soulevez la moitié inférieure d'une assiette inversée du banc, puis touchez la boucle, le bâton ou le cure-dent jusqu'au premier quadrant près de la fin de la dernière série. En utilisant le modèle de va-et-vient, traversez la dernière moitié des stries dans le premier quadrant, puis déplacez-vous dans le deuxième quadrant vide. Retournez et remettez la plaque dans le couvercle sur le banc une fois que le deuxième quadrant est rempli.

La boucle, le bâton ou le cure-dent ne doivent jamais retourner dans la première moitié des stries du premier quadrant où la majeure partie de l'inoculum d'origine a été déposée.

Une nouvelle boucle en plastique, un bâton en bois ou un cure-dent doit être utilisé pour chaque quadrant.

Répétez l'étape 6 deux fois pour les troisième et quatrième quadrants.

Assurez-vous de jeter le bâton ou le cure-dent ou de reflammer la boucle métallique entre chaque quadrant.

Évitez d'entrer dans le premier quadrant lorsque vous faites des stries dans le quatrième quadrant.

Incuber la plaque à l'envers afin que la condensation qui s'accumule sur le couvercle ne goutte pas sur les colonies.

3. Procédure de la plaque de coulée : dénombrement des cellules bactériennes dans un échantillon mixte

Cette méthode est souvent utilisée pour compter le nombre de micro-organismes dans un échantillon mélangé, qui est ajouté à un milieu gélosé fondu avant sa solidification. Le processus aboutit à des colonies uniformément réparties dans le milieu solide lorsque la dilution d'échantillon appropriée est étalée. Cette technique est utilisée pour effectuer des comptages sur plaques viables, dans lesquels le nombre total d'unités formant des colonies dans la gélose et à la surface de la gélose sur une seule plaque est dénombré. Les comptages sur plaques viables fournissent aux scientifiques un moyen normalisé de générer des courbes de croissance, de calculer la concentration de cellules dans le tube à partir duquel l'échantillon a été étalé et d'étudier l'effet de divers environnements ou conditions de croissance sur la survie ou le taux de croissance des cellules bactériennes.

Étiquetez le pourtour du fond (pas le couvercle) d'une boîte de Pétri stérile mais vide avec au moins votre nom, la date, le type de milieu de croissance et le type d'organisme à ajouter au milieu gélosé fondu.

Inclure le facteur de dilution si placage dilutions en série, soit une série de dilutions répétées, ce qui entraîne une réduction systématique de la concentration de cellules dans l'échantillon. La préparation de dilutions en série est nécessaire si le nombre de cellules dans l'échantillon dépasse la capacité de la plaque de gélose, dans laquelle la plage statistiquement significative est de 30 à 300 cfu. S'il y a plus de 300 ufc sur une plaque, alors les colonies seront surpeuplées et se chevaucheront.

Obtenir un tube contenant 18 ml de milieu gélosé fondu.

Le milieu gélosé doit être distribué dans des tubes à essai et pré-stérilisé dans un autoclave. Le même jour, il est nécessaire pour une expérience, la gélose doit être fondue dans un cuiseur vapeur pendant 30 minutes puis transférée dans un bain-marie à 55 ° C. Seule la quantité de gélose nécessaire à l'expérience doit être fondue car elle ne peut pas être réutilisée.

Dix minutes avant de verser les plaques, les tubes de gélose fondue doivent être transférés du bain-marie à 55 °C vers un bloc chauffant sur la paillasse du laboratoire réglé à 48 °C. Une fois que la gélose atteint cette température, elle est prête à être versée. Si la gélose est trop chaude, les bactéries présentes dans l'échantillon peuvent être tuées. Si la gélose est trop froide, le milieu peut être grumeleux une fois solidifié.

Obtenez votre échantillon, qui doit être soit un bouillon de culture, soit une suspension de cellules produites en mélangeant des cellules d'une colonie dans un tampon ou une solution saline.

Les échantillons peuvent être dérivés d'une série de dilutions d'un seul échantillon.

Le volume d'échantillon à plaquer doit être compris entre 0,1 et 1,0 ml.

Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri vide et déposez votre échantillon au milieu de la plaque (Panneau A de Figure 4). Ferme la couverture.

Utilisez une technique aseptique tout au long de cette procédure.

Utilisez une pipette sérologique ou une micropipette pour transférer votre échantillon sur la plaque. Contrôlez le débit de l'échantillon afin qu'il ne s'échappe pas de la plaque.

Retirez le capuchon du tube de gélose fondue et passez le bord du tube ouvert à travers la flamme du bec Bunsen.

Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri contenant votre échantillon et versez la gélose avec précaution (Panneau B de Figure 4).Fermez le couvercle puis mélangez l'échantillon avec la gélose en remuant doucement la plaque.

Laisser la gélose se solidifier complètement avant de retourner la plaque pour l'incubation.

4. Procédure de plaque d'étalement : formation de colonies bactériennes discrètes pour le dénombrement sur plaque, l'enrichissement, la sélection ou le criblage

Cette technique est généralement utilisée pour séparer les micro-organismes contenus dans un petit volume d'échantillon, qui est réparti sur la surface d'une plaque de gélose, entraînant la formation de colonies discrètes réparties uniformément sur la surface de la gélose lorsque la concentration appropriée de cellules est plaquée. En plus d'utiliser cette technique pour les dénombrements sur plaques viables, dans laquelle le nombre total d'unités formant des colonies sur une seule plaque est dénombré et utilisé pour calculer la concentration de cellules dans le tube à partir duquel l'échantillon a été ensemencé, le placage étalé est couramment utilisé dans des expériences d'enrichissement, de sélection et de criblage. Le résultat souhaité pour ces trois expériences est généralement le même que pour les comptages sur plaque, dans lesquels une distribution de colonies discrètes se forme à travers la surface de la gélose. Cependant, le but n'est pas de garantir tous les cellules viables forment des colonies. Au lieu de cela, seules les cellules d'une population qui ont un génotype particulier devraient se développer. La procédure de plaque d'étalement peut être utilisée par rapport à la technique de la plaque de coulée pour une expérience de dénombrement si l'objectif final est d'isoler les colonies pour une analyse plus approfondie, car les colonies se développent de manière accessible sur la surface de la gélose alors qu'elles s'incrustent dans la gélose avec la procédure de la plaque de coulée.

Il existe deux stratégies décrites ici pour la procédure de la plaque d'étalement. La première (méthode A) implique l'utilisation d'un plateau tournant et d'une tige de verre ou de métal en forme de bâton de hockey. La seconde (méthode B), appelée « méthode de Copacabana », consiste à secouer des billes de verre pré-stérilisées. Les deux facilitent la propagation uniforme des cellules sur la surface de la gélose.

Méthode A : placage étalé avec une plaque tournante et une tige de verre ou de métal

Étiquette autour du bord du fond (pas le couvercle) d'une plaque de gélose avec au moins votre nom, la date, le type de milieu de croissance et le type d'organisme à étaler sur le milieu.

Inclure le facteur de dilution si placage dilutions en série.

Les plaques doivent être complètement sèches sans condensation sur le couvercle et préchauffées à température ambiante avant d'être étalées. Si les plaques sont conservées à 4 ଌ, retirez-les plusieurs heures voire la veille. Étalez-les en petites piles décalées de 2 à 3 assiettes maximum et laissez-les sécher.

Centrez le plateau sur le plateau tournant (Figure 5).

Obtenez votre échantillon, qui devrait être un bouillon de culture ou une suspension de cellules produites en mélangeant des cellules d'une colonie dans un tampon ou une solution saline.

Les échantillons peuvent être dérivés d'une série de dilutions d'un seul échantillon.

Le volume d'échantillon à plaquer doit être compris entre 0,1 et 0,2 ml.

Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri et déposez votre échantillon au centre de la gélose. Ferme la couverture.

Utilisez une technique aseptique tout au long de cette procédure.

Utilisez une micropipette pour transférer votre échantillon sur la plaque. Contrôlez le débit de l'échantillon afin qu'il ne s'échappe pas de la plaque.

Trempez la tige de verre ou la tige de métal (également appelée écarteur) dans un bécher d'éthanol à 70 % (v/v).

ATTENTION : Ne plongez jamais un épandeur chaud dans un bécher d'alcool.

L'éthanol ne doit toucher que la partie inférieure de l'épandeur et le premier pouce de la tige.

Égoutter et enflammer l'excès d'éthanol en le faisant passer à travers la flamme d'un bec Bunsen.

La flamme doit parcourir la longueur de l'épandeur et de la tige qui sont entrés en contact avec l'éthanol, puis s'éteindre rapidement.

Si le bécher d'éthanol prend feu, pas de panique ! Placez un couvercle en verre sur le bécher, ce qui éteint rapidement le feu.

Ouvrez le couvercle de la plaque de gélose, en tenant le couvercle dans votre main gauche avec votre pouce et votre index. Refroidissez l'épandeur en le touchant à la gélose le long du bord près du bord.

Ne touchez pas la gélose où les cellules ont été ajoutées. L'épandeur chaud tuera les cellules.

Avec votre main gauche (tout en tenant toujours le couvercle de la plaque de gélose), faites tourner lentement le plateau tournant.

Bien qu'il soit préférable d'éviter, si vous devez baisser le couvercle, placez-le face vers le bas sur une surface désinfectée dans le champ stérile du bec Bunsen. Avec un couvercle orienté vers le haut, les risques de contamination par les mouvements d'objets ou de mains sont plus grands, créant des courants d'air qui font descendre des micro-organismes et des particules de poussière sur la surface intérieure du couvercle.

Avec votre main droite, maintenez doucement l'épandeur sur la surface de la gélose et étalez progressivement l'échantillon uniformément sur toute la plaque. Déplacez l'épandeur d'avant en arrière sur la plaque pendant que le plateau tournant tourne.

Laisser l'échantillon s'absorber complètement (au moins 5 minutes) avant de retourner la plaque pour l'incubation.

Méthode B : Placage étalé avec des billes de verre : la « Méthode Copacabana »

Étiquette autour du bord du fond (pas le couvercle) d'une plaque de gélose avec au moins votre nom, la date, le type de milieu de croissance et le type d'organisme à étaler sur le milieu.

Inclure le facteur de dilution si placage dilutions en série.

Ouvrez le couvercle de la plaque de gélose, en tenant le couvercle dans votre main gauche avec votre pouce et votre index. Ensuite, ouvrez le tube ou le flacon en verre contenant des billes de verre pré-stérilisées. Avec votre main droite, flambez le bord du tube ou du flacon puis déposez soigneusement 10 à 12 billes de verre stériles sur une plaque de gélose (Figure 6). Fermez le couvercle de la plaque et flambez à nouveau le bord du tube ou de la bouteille avant de remettre le capuchon en place et de le mettre de côté.

Versez doucement les billes hors du tube ou de la bouteille quelques centimètres au-dessus de la gélose afin que les billes ne rebondissent pas hors de la boîte de Pétri.

Utilisez des billes de verre de 4 mm de diamètre. Stérilisez-les dans des bouteilles en verre ou des tubes à essai dans l'autoclave à 121 ଌ sur le cycle de séchage (réglage de la gravité) pendant 30 minutes.

L'un des avantages d'utiliser des billes au lieu d'un épandeur est qu'aucun récipient ouvert d'éthanol n'est nécessaire pour un flambage répété.

Ouvrez le couvercle de la plaque de gélose et déposez votre échantillon au centre de la gélose. Ferme la couverture.

Utilisez une technique aseptique tout au long de cette procédure.

Aliquoter 100 à 150 μl d'échantillon par plaque. Ce volume facilitera même l'étalement des cellules. Utilisez une micropipette pour transférer votre échantillon sur la plaque. Contrôlez le débit de l'échantillon afin qu'il ne s'échappe pas de la plaque.

Étaler l'échantillon en secouant doucement les billes sur la surface de la gélose 6 à 7 fois. Pour assurer une répartition uniforme des cellules, utilisez un mouvement d'agitation horizontal.

Ne faites pas tourbillonner les billes, sinon toutes les cellules se retrouveront au bord de la plaque.

ASTUCE : Si elle est effectuée correctement, la procédure ressemble à « secouer des maracas ».

Tournez la plaque 60° puis secouez à nouveau horizontalement 6 à 7 fois.

Faites tourner la plaque de 60° une deuxième fois et secouez à nouveau horizontalement. À présent, vous devriez obtenir une répartition uniforme des cellules sur la surface de la gélose.

Une fois l'étalement terminé, l'échantillon doit être absorbé et la surface de la gélose doit être sèche. Verser les billes contaminées dans un bécher de collecte marqué contenant 10 % d'eau de Javel.

Ne jetez pas les billes à la poubelle ! Les billes utilisées seront rincées et stérilisées à l'autoclave, les re-stérilisant pour une utilisation répétée.

REMARQUE : Si la surface de la gélose est encore humide après avoir secoué trois fois, laissez la plaque reposer pendant plusieurs minutes pour permettre au liquide d'être absorbé par la gélose, puis répétez les étapes 4 à 6 jusqu'à ce que la surface de la plaque apparaisse sèche.

Inverser la plaque pour l'incubation.

5. Procédure de superposition de gélose molle : formation de plaques pour l'isolement et le dénombrement des phages (essai sur plaque)

Cette technique est couramment utilisée pour détecter et quantifier les bactériophages (phages) ou virus bactériens dont la taille varie de 100 à 200 nm. Un microscope électronique est nécessaire pour voir les particules de phage individuelles. Cependant, la présence de particules phagiques infectieuses peut être détectée comme plaques sur une plaque de gélose (Figure 7A). Les phages ne peuvent pas se répliquer en dehors de leurs cellules bactériennes hôtes, de sorte que la propagation et la détection nécessitent le mélange des phages et des cellules hôtes avant l'étalement. Pour la procédure de superposition de gélose molle, un petit volume, généralement compris entre 50 μl et 200 μl, d'une suspension de phages est distribué dans un tube contenant environ 10 8 bactéries (cellules hôtes) qui sont uniformément dispersées dans 2,5 -3,0 ml de gélose nutritive molle (0,5 à 0,7% [p/v]) fondue. Le mélange résultant est versé sur la surface d'une plaque de gélose nutritive dure (1,5 à 1,9 % [p/v]). La plaque est suffisamment secouée pour garantir que la gélose molle recouvre toute la surface de la gélose dure. Ensuite, la plaque est placée sur une surface plane jusqu'à ce que la couche supérieure de gélose ait eu le temps de se solidifier et puisse ensuite être placée dans l'incubateur.

Au fil du temps, une suspension trouble de cellules bactériennes, appelée pelouse, devient visible dans tout le milieu gélosé mou (Figure 7B). Des plaques se forment si un phage infecte l'une des cellules bactériennes, se réplique dans la cellule, puis lyse la cellule en libérant jusqu'à 100 phages descendants (alias, le taille d'éclatement). Les nouvelles particules de phage diffusent dans la gélose molle, infectant les bactéries dans la zone entourant la cellule bactérienne lysée. Après plusieurs cycles d'infection et de lyse, la suspension cellulaire bactérienne trouble dans la gélose molle disparaît, laissant une zone de compensation appelée plaque. Chaque plaque contient plus de 10 9 particules de phage, toutes génétiquement identiques à la particule de phage infectieuse d'origine. Parce qu'une plaque se forme à partir d'une seule particule de phage, le nombre résultant de unités de formation de plaque (pfu) peut être compté et la concentration d'origine, ou titre, de la suspension de phages peut être calculé. Ce type d'expérience, appelé test de plaque, fournit également aux scientifiques un moyen standardisé de générer des courbes de croissance en une étape, d'étudier la spécificité de la gamme d'hôtes et de transduire des cellules bactériennes pour des expériences génétiques.

Préparez les bactéries indicatrices : Une culture à croissance exponentielle de la souche hôte bactérienne doit être préparée pour l'expérience de superposition de gélose molle. Chaque hôte a ses propres exigences de croissance. Entre 0,3 ml et 0,5 ml d'une suspension de bactéries indicatrices est nécessaire pour chaque plaque. Si un flacon de bactéries indicatrices est préparé (p. Les tubes peuvent être conservés sur la glace (à 4 ଌ) jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être utilisés dans l'expérience. Utiliser une technique aseptique pour inoculer un bouillon nutritif stérile puis incuber selon les spécifications de la souche bactérienne. Les restes de culture doivent être jetés à la fin de la journée.

Préparez les tubes d'adsorption : Placer deux tubes de microcentrifugation stériles dans un rack. Étiquetez le couvercle du premier tube "Phage" et le couvercle du deuxième tube "Contrôle".

Typiquement dilutions en série de lysats de phages sont préparés et étalés, auquel cas des tubes de microcentrifugation supplémentaires seraient ajoutés au support et étiquetés avec le facteur de dilution.

Les stocks de phages doivent être préparés à partir de plaques individuelles et stockés à 4 ଌ. Pour désagréger les particules de phage, les stocks doivent être réchauffés à température ambiante avant d'effectuer une expérience.

Les stocks de phages doivent être manipulés avec précaution - ne pas vortexer ni pipeter vigoureusement.

Ajoutez 50 μl de votre échantillon de phage dans le premier tube, puis ajoutez 50 μl de tampon de phage dans le deuxième tube, qui servira de contrôle négatif pour le test de plaque.

Utiliser une technique aseptique lors de toutes les manipulations de phages et de bactéries.

Ajoutez ensuite 500 μl de bactéries indicatrices dans chaque tube d'adsorption.

Les cellules bactériennes se déposent au fond d'un tube si elles sont assises sur de la glace ou sur un banc pendant de longues périodes. Si la culture n'est pas mélangée avant de retirer une aliquote pour l'expérience, pas assez de cellules bactériennes seront transférées dans le tube d'adsorption. Il doit y avoir un nombre suffisant de colonies bactériennes formées dans la gélose molle (c'est-à-dire une pelouse) pour la détection des plaques. Utilisez un mélangeur vortex pour remettre doucement en suspension les bactéries indicatrices dans une suspension homogène avant de transférer des aliquotes dans les tubes d'adsorption.

Mélanger les cellules bactériennes et le phage en effleurant doucement les tubes.

Incuber le mélange phages/bactéries pendant 15 à 20 minutes (pas plus de 30 minutes) à une température appropriée pour la souche indicatrice.

Préparez des plaques de gélose molle et de gélose dure nutritive : Pendant que l'adsorption se produit, placez deux tubes de gélose molle (préalablement fondus et stockés à 55 ଌ) dans un bloc chauffant sur votre paillasse de laboratoire réglé à 46-48 ଌ.

La gélose molle fondue doit être équilibrée à la température du bloc chauffant pendant 10 à 15 minutes. Si la gélose molle fondue reste plus de 15 minutes, elle commencera à se solidifier et formera des grumeaux lorsqu'elle sera versée sur la gélose dure. Si la gélose molle fondue repose moins de 10 minutes, elle sera trop chaude lorsqu'elle sera ajoutée au mélange phage/bactérie, tuant les cellules hôtes avant l'étalement. Par conséquent, une pelouse peut ne pas se former et peu ou pas de plaques peuvent être détectables.

Préparez des tubes de gélose molle supplémentaires si vous étalez des dilutions en série du lysat de phage.

Étiquetez le pourtour du fond (pas le couvercle) de deux plaques de gélose dure nutritive avec au moins votre nom, la date, le type de milieu de croissance et « Phage » ou « Contrôle » correspondant aux tubes d'adsorption.

Incluez des plaques supplémentaires étiquetées avec le facteur de dilution si vous étalez des dilutions en série.

Les plaques de gélose dure doivent être complètement sèches sans condensation sur le couvercle et préchauffées à température ambiante avant d'ajouter la gélose molle. Si les plaques sont conservées à 4 ଌ, retirez-les plusieurs heures voire la veille. Étalez-les en petites piles décalées de 2 à 3 assiettes maximum et laissez-les sécher. Une humidité excessive dans la couche de gélose dure entraînera la dilution de la gélose molle, permettant aux phages de se diffuser plus facilement à travers la gélose molle pendant la formation de la plaque. Par conséquent, la taille de la plaque augmentera.

Plaquer les tubes d'adsorption un à la fois comme suit : Utilisez une micropipette P1000 pour transférer aseptiquement le mélange de phages/bactéries (devrait être d'environ 550 μl) dans un tube de gélose molle, puis faites-le pivoter rapidement entre les paumes de vos mains pour mélanger le contenu. NE PAS secouer le tube pour introduire des bulles d'air. En tenant le tube dans votre main gauche, ouvrez le couvercle d'une plaque de gélose dure avec votre main droite et immédiatement verser tout le contenu du tube sur la surface d'une plaque de gélose dure. Avant de fermer le couvercle, secouez doucement mais rapidement la plaque pour étaler la gélose molle fondue sur toute la surface de la plaque avant qu'elle n'ait le temps de se solidifier. Évitez d'éclabousser la gélose molle fondue sur les côtés de la boîte de Pétri. Ferme la couverture.

Répétez l'étape 9 pour tous les tubes d'adsorption, un tube à la fois.

Placez les plaques sur une surface plane et laissez-les reposer jusqu'à ce que la gélose molle soit solidifiée.

En général, 30 minutes suffisent.

Inverser les plaques pour l'incubation.

Plusieurs plaques peuvent être empilées et scotchées ensemble puis inversées pour l'incubation.

Après incubation, les plaques peuvent être inspectées à la recherche de plaques. Le contrôle négatif ne doit avoir qu'un tapis de bactéries (pas de trous indiquant des plaques). Les plaques varient en termes de taille, de forme et d'apparence générale. Un type de phage donné peut être isolé d'un mélange hétérogène de plaques en poinçonnant soigneusement le centre d'une plaque avec un cure-dent stérile et en transférant l'inoculum dans un tube de microcentrifugation stérile contenant 100 à 1000 μl de bouillon ou de tampon de phage. Ce lysat peut être plaqué en utilisant la même procédure décrite ci-dessus. Au moins 3 à 6 isolements successifs à plaque unique sont nécessaires pour s'assurer qu'un phage pur a été obtenu. Souvent, le lysat doit être dilué sur une large plage (10 -1 à 10 -10 ) pour trouver un titre qui produit des plaques non chevauchantes sur une plaque. Le nombre varie en fonction de la taille de la plaque.

6. Procédure de plaque de réplique : transfert de cellules pour le dépistage de mutants et d'auxotrophes

Cette technique permet de comparer la croissance cellulaire sur une plaque primaire à des plaques secondaires, générant un moyen de cribler les cellules pour un phénotype sélectionnable. Tout d'abord, une plaque primaire, ou maîtresse, est inoculée avec des cellules soit en étalant une dilution qui produit des colonies uniques, soit en les transférant sur une plaque selon un schéma spatial spécifié par des marquages ​​​​de grille. Des plaques secondaires contenant des milieux avec des inhibiteurs de croissance ou des milieux dépourvus d'un nutriment particulier sont inoculées avec des cellules de colonies sur la plaque primaire. Le motif spatial des colonies est d'abord reproduit en pressant un morceau de velours sur la plaque primaire. Les cellules bactériennes adhèrent au velours car elles ont une plus grande affinité pour le velours que pour la gélose. L'empreinte des cellules sur le velours est ensuite transférée sur plusieurs plaques secondaires avec une croissance cellulaire reflétant le même motif de colonie que celui de la plaque primaire. En d'autres termes, c'est comme avoir un tampon en caoutchouc, reproduisant le modèle de croissance d'une plaque à l'autre. Cette technique est avantageuse car elle permet à un nombre relativement important de colonies d'être criblées simultanément pour de nombreux phénotypes en une seule expérience.

Préparer la plaque primaire : Étiquette autour du bord du fond (pas le couvercle) d'une plaque de gélose avec au moins votre nom, la date et le type de milieu de croissance.

Tracez une grille sur le fond de la plaque avec au moins deux lignes verticales équidistantes et au moins deux lignes horizontales équidistantes. Numérotez les carrés obtenus.

Utilisez un cure-dent pré-stérilisé pour inoculer chaque carré avec un échantillon de cellules. Pour chaque échantillon, tamponnez le centre du carré. Ne couvrez pas tout le carré avec des cellules (Figure 8) ou bien l'échantillon proliférera lors de l'incubation et contaminera les carrés environnants.

Chaque carré sera ensemencé avec un échantillon différent, issu soit de cultures en bouillon, soit de colonies sur une autre plaque.

Retourner et incuber la plaque primaire, qui sera utilisée pour ensemencer divers milieux secondaires.

Inoculer les plaques secondaires : Empilez la plaque primaire et toutes les plaques secondaires. Avec un marqueur, faites une marque d'orientation sur le côté des plaques. Assurez-vous que la marque est sur le côté inférieur de chaque assiette, pas sur le couvercle.

Procurez-vous un chiffon de velours stérile et placez-le sur le bloc cylindrique (Figure 9). Verrouillez le chiffon de velours en place avec le support. Notez la marque d'orientation sur le bloc.

Le bloc doit être de la même taille que le fond d'une boîte de Pétri (10,2 cm de diamètre). Il devrait venir avec un anneau de verrouillage qui serre le tissu de velours au bloc pendant le placage de réplique.

Le tissu en velours (15,2 x 15,2 cm carré) doit être pré-stérilisé. Empilez 10 ou 12 carrés propres puis enveloppez-les dans du papier aluminium puis placez-les dans l'autoclave à 121 ଌ sur le cycle de séchage (réglage gravité) pendant 30 minutes. Avant de les utiliser dans une expérience de placage de réplique, assurez-vous qu'ils sont complètement secs en les plaçant dans un four chaud pendant plusieurs heures. Notez que les carrés de velours peuvent avoir besoin d'être délintés avec du ruban adhésif avant la stérilisation.

Les carrés de velours peuvent être réutilisés. Une fois que les carrés de velours usagés ont été décontaminés dans l'autoclave, ils doivent être rincés à l'eau claire et restérilisés comme décrit ci-dessus.

Le bloc cylindrique et la pince doivent être désinfectés entre les utilisations avec un bref rinçage dans de l'éthanol à 70 % (v/v) ou de l'eau de Javel à 10 %.

Retirez le couvercle et retournez la plaque primaire. Alignez la marque d'orientation sur la plaque avec la marque sur le bloc. Abaisser la plaque de manière à ce que la surface de la gélose soit en contact avec le tissu de velours sur le bloc cylindrique. Appuyez légèrement mais uniformément du bout des doigts sur le dos de la plaque primaire, puis soulevez délicatement la plaque primaire pour l'éloigner du bloc. Replacez le couvercle sur la plaque.

L'empreinte de velours des cellules de la plaque primaire peut être utilisée pour inoculer environ 7 à 8 plaques secondaires avant qu'une empreinte avec un nouveau velours ne doive être faite.

Répétez l'étape 7 avec chacune des plaques secondaires.

En tant que contrôle positif, la dernière plaque de la série doit être un milieu gélosé dans lequel toutes les souches testées doivent croître. De cette façon, vous pouvez confirmer que les cellules ont été transférées sur toutes les plaques secondaires de la série. Sinon, le manque de croissance sur un milieu d'essai particulier peut être attribué à un transfert cellulaire insuffisant plutôt qu'à un phénotype de la souche.

Pour éviter les faux positifs, les plaques secondaires doivent être commandées du substrat le moins favorable au substrat le plus favorable. Sinon, les nutriments pourraient être transférés entre les plaques permettant aux cellules de se développer sur un milieu défavorable.

Inverser les plaques et incuber.

Remarque : Lors de l'inspection des plaques secondaires pour la croissance, assurez-vous de faire la distinction entre la croissance et une empreinte. Ce dernier est un résultat négatif.

7. Nettoyer l'espace de travail

Éteignez le bec Bunsen, puis rangez toutes les fournitures, y compris les cultures sur plaques ou en tubes, les milieux supplémentaires et les autres réactifs.

Ne laissez pas les anciennes cultures, que ce soit sur des plaques ou dans des tubes, s'accumuler sur la paillasse du laboratoire ou dans les zones de stockage. Ces échantillons, qui sont des sources notoires de contamination comme les moisissures et les espèces bactériennes indésirables, doivent être jetés dès qu'ils ne sont plus nécessaires.

Placez le matériel de laboratoire contaminé (gants, embouts de pipette, lingettes), la verrerie (tubes, flacons, bouteilles) et les déchets dangereux (cultures bactériennes ou solutions de phages, plaques usagées) dans le réceptacle d'élimination approprié. Lorsque vous travaillez avec un non-pathogène E. coli (BSL-1), seuls des déchets dangereux non infectieux sont générés. Lors de l'exécution de ces mêmes procédures avec des organismes pathogènes (BSL-2 ou supérieur), des déchets dangereux infectieux sont générés. Indépendamment de la classification des risques biologiques, les déchets dangereux doivent être autoclavés ou désinfectés avant d'être jetés. Suivez les directives décrites dans le BMBL (5 e éd.) ainsi que celles fournies par votre service institutionnel de santé et de sécurité environnementales pour l'élimination immédiate et appropriée des risques biologiques générés lors d'une expérience.

Nettoyer la zone de travail avec un désinfectant.

Se laver soigneusement les mains avec du savon antiseptique et de l'eau tiède avant de quitter le laboratoire.

8. Résultats représentatifs

Technique de la plaque striée. Un exemple d'application pour le placage strié est montré dans Figure 1. Cette procédure est utilisée pour isoler des colonies bactériennes à partir de cultures cellulaires mixtes et est de loin l'une des techniques les plus importantes à maîtriser en microbiologie et en génétique moléculaire. Chaque colonie représente une population de cellules génétiquement identiques. Pour de nombreuses applications en aval, il est impératif de commencer avec une seule colonie ou une culture bactérienne pure générée en inoculant des milieux avec des cellules d'une seule colonie. Par exemple, la morphologie des cellules individuelles au sein d'une colonie peut être inspectée à l'aide d'un microscope optique. L'identité génétique peut être attribuée en séquençant le gène de l'ARN ribosomique de la petite sous-unité à partir de l'ADN génomique isolé à partir d'une culture cellulaire commencée avec une seule colonie. Et les caractéristiques métaboliques peuvent être décrites en soumettant les cellules à divers tests biochimiques et physiologiques. Ce n'est qu'en réalisant de telles expériences avec des cultures pures que l'on peut être certain des propriétés attribuées à un micro-organisme particulier. Les résultats ne sont pas obscurcis par la possibilité que la culture soit contaminée. Des erreurs techniques peuvent survenir si la stérilité de l'instrument utilisé pour étaler les cellules sur la plaque n'est pas maintenue tout au long de la procédure. Oublier de flamber une boucle ou de récupérer un cure-dent frais entre les quadrants, il est difficile d'obtenir des colonies uniques. Certaines espèces bactériennes ne peuvent pas être isolées en culture pure car elles dépendent d'une association coopérative avec une autre espèce bactérienne pour certaines exigences de croissance. Appelés syntrophes, ces organismes ne peuvent être cultivés que dans des conditions de co-culture, de sorte que les colonies (si elles sont formées) seront toujours composées de deux espèces ou plus. Un autre défi rencontré en laboratoire lors de l'exécution de la procédure de la plaque à stries avec des bactéries dérivées d'échantillons environnementaux est que les cellules présentent des caractéristiques de croissance qui s'écartent des souches de laboratoire traditionnelles telles que E. coli. De telles souches bactériennes peuvent produire des colonies filamenteuses (par opposition à des amas serrés de cellules) avec des branches qui s'étendent sur une grande partie d'une plaque de gélose, calcifiées et donc réfractaires à la pénétration d'un instrument à plaque à stries, ou entourées d'une capsule collante de sorte que les colonies individuelles ne peuvent pas être discernées. Ces caractéristiques rendent difficile la purification de colonies isolées par la technique de la plaque striée.

Technique de la plaque de coulée. Avec la technique de la plaque de coulée, les colonies se forment à l'intérieur de la gélose ainsi qu'à la surface du milieu gélosé, offrant ainsi un moyen pratique de compter le nombre de cellules viables dans un échantillon. Cette procédure est utilisée dans une variété d'applications industrielles. Par exemple, il est essentiel pour une usine de traitement des eaux usées, qui est responsable du nettoyage des déchets liquides (p. échantillons après le processus de purification extensif. Les eaux usées traitées (eau non potable) sont réutilisées de diverses manières - pour l'irrigation des cultures non alimentaires en agriculture, pour le rinçage sanitaire des résidences et dans les tours de refroidissement industrielles - elles doivent donc être exemptes de contamination chimique et microbienne. L'eau potable (eau potable) doit être purifiée conformément aux normes de l'EPA et est testée à l'aide de méthodes de placage microbiologique qui permettent le dénombrement d'agents pathogènes humains spécifiques. Montré dans Figure 10 sont des colonies bactériennes résultant de cellules bactériennes présentes dans un échantillon d'eau prélevé à une fontaine publique. Il est peu probable que des agents pathogènes bactériens aient produit ces colonies étant donné les mesures de purification de l'eau potable. Cependant, les microbes sont partout et la contamination par des souches même non pathogènes ne peut être que minimisée, pas entièrement éliminée. Autre exemple, une société pharmaceutique doit évaluer le degré de contamination microbienne, ou biocharge, d'un nouveau médicament pendant la production, le stockage et le transport. En échantillonnant le médicament au cours des différentes phases du processus et en plaquant les échantillons à l'aide de la procédure de coulée sur plaque, la charge microbienne, ou le nombre de bactéries contaminantes, peut être facilement déterminé. Des mesures de précaution peuvent alors être conçues pour minimiser ou éliminer la contamination microbienne. L'une des erreurs techniques les plus courantes qui se produisent lors de l'exécution de la technique de la plaque de coulée est un mélange insuffisant de l'échantillon avec la gélose fondue, ce qui provoque l'agglutination des colonies, ce qui rend les décomptes sur plaque inexacts. Une autre erreur fréquente consiste à verser la gélose fondue lorsqu'elle est trop chaude, tuant de nombreuses cellules bactériennes de l'échantillon. Cette erreur affectera également la précision des comptages sur plaque donnant des nombres qui sous-représentent le nombre total d'unités formant des colonies dans l'échantillon.

Technique de la plaque étalée. La technique de la plaque étalée est analogue à la procédure de la plaque de coulée dans son utilité en tant que moyen d'effectuer des comptages de plaques viables. Cependant, étant donné que les colonies qui se forment à l'aide de la technique de la plaque étalée sont uniformément réparties sur la surface du milieu gélosé, les cellules des colonies individuelles peuvent être isolées et utilisées dans des manipulations expérimentales ultérieures (par exemple, comme inoculum pour une plaque à rayures ou un bouillon de culture). Trois applications courantes dans lesquelles la technique de la plaque étalée est un élément important sont les expériences d'enrichissement, de sélection et de criblage. Dans les trois applications, le type cellulaire souhaité peut être séparé du mélange et ensuite soumis à un certain nombre de tests biochimiques, physiologiques ou génétiques.

Un expérience d'enrichissement implique l'étalement d'une culture mixte sur un milieu ou l'incubation de plaques dans des conditions environnementales qui favorisent la croissance de ces micro-organismes au sein de l'échantillon qui démontrent les propriétés métaboliques, les caractéristiques de croissance ou les comportements souhaités. Cette stratégie n'inhibe pas la croissance d'autres organismes mais entraîne une augmentation du nombre de micro-organismes souhaités par rapport aux autres dans la culture. Ainsi, les colonies qui se forment sur une plaque d'enrichissement présentent probablement des propriétés phénotypiques qui reflètent le génotype souhaité. Par exemple, si votre objectif est de cultiver des bactéries fixatrices d'azote à partir d'un échantillon environnemental contenant un mélange de plus de 1000 espèces bactériennes différentes, alors le placage de l'échantillon sur un milieu pauvre en azote enrichira les bactéries qui peuvent produire ce composé à partir du l'atmosphère en utilisant les capacités métaboliques fournies par une suite de gènes nécessaires à la fixation de l'azote.

UNE expérience de sélection implique l'étalement d'une culture mixte sur un milieu qui permet uniquement aux cellules qui contiennent un gène particulier ou un ensemble de gènes de se développer. Ce type d'expérience est courant dans les laboratoires de biologie moléculaire lors de la transformation de souches bactériennes avec des plasmides contenant des gènes de résistance aux antibiotiques. Si votre objectif est de cultiver uniquement des cellules recombinantes, ou celles qui ont réussi à absorber le plasmide, alors le placage de l'échantillon sur un milieu qui a été complété avec une concentration appropriée de l'antibiotique sélectionnera les cellules qui présentent une résistance à ce médicament particulier.

UNE expérience de dépistage implique l'étalement d'une culture mixte sur un milieu qui permet à toutes les cellules viables de se développer cependant, les cellules avec le génotype souhaité peuvent être distinguées des autres cellules en fonction de leur phénotype. Encore une fois, ce type d'expérience est courant dans les laboratoires de biologie moléculaire lors de la réalisation d'essais de mutagenèse ou de clonage de gènes dans des plasmides. Un exemple classique, comme le montre Figure 11, utilise le lacZ gène codant pour la β-galactosidase cette enzyme permet aux cellules de métaboliser X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un substrat analogue de son substrat naturel, le lactose. Le clivage de X-Gal par la β-galactosidase donne un produit bleu insoluble. Ainsi, si un milieu contient du X-gal, et un échantillon contenant des cellules avec soit un type sauvage (fonctionnel) soit un mutant (non fonctionnel) lacZ gène sont étalés sur ce milieu, puis après incubation des cellules de type sauvage abritant une fonction lacZ Le gène apparaîtra sous forme de colonies pigmentées en bleu tandis que les cellules mutantes avec un lacZ gène apparaîtra sous forme de colonies non pigmentées ("blanches").

Un problème technique rencontré le plus souvent lors de l'apprentissage initial de la technique de la plaque étalée est la répartition inégale des cellules sur la surface de la gélose. Lors de l'utilisation d'un plateau tournant et d'une tige de verre, l'échantillon peut être absorbé trop rapidement de sorte que les colonies ne se forment qu'à proximité du centre de la plaque. Lors de la "méthode de Copacabana", les billes de verre sont tourbillonnées plutôt que secouées sur la surface de la gélose. Par conséquent, de nombreuses colonies se développent le long du bord extérieur de la plaque. Dans les deux cas, la distribution résultante des colonies ne profite pas de la surface totale disponible, de sorte que les cellules peuvent s'agglutiner et se développer en colonies qui se chevauchent, ce qui rend les dénombrements sur plaque inexacts ou la distinction des types cellulaires impossible.

Technique de superposition de gélose molle. Une procédure semblable à la technique de la plaque d'étalement utilisée pour compter les colonies bactériennes peut être utilisée pour compter le nombre de phages. Alors qu'entre 30 et 300 cellules bactériennes sont réparties sur la surface de la gélose pour les dénombrements sur plaque (cfu/ml), entre 100 et 400 particules de phage infectieuses sont mélangées avec 10 8 à 10 9 cellules hôtes pour le dénombrement des plaques (pfu/ml) dans une couche de gélose molle étalée sur la surface de la gélose nutritive dure. Sauf preuve contraire, il est généralement admis qu'une seule cellule bactérienne se divise et accumule un grand nombre de cellules génétiquement identiques dans un seul groupe appelé colonie. Comme indiqué précédemment, cette hypothèse n'est pas valable lorsque les cellules se développent en grappes (c'est-à-dire des paires, des tétrades, des chaînes ou des grappes) ou présentent des caractéristiques de croissance telles que des capsules qui entravent la formation d'une seule colonie. Une hypothèse similaire est faite pour la formation de plaque, en ce que chaque plaque représente l'activité d'un seul phage. Cette affirmation n'est vraie que si un phage infecte une bactérie. Que se passe-t-il si plusieurs particules de phage infectent une seule bactérie ? Ce problème concerne un paramètre statistique important qui doit être pris en compte lors de la réalisation d'expériences avec le phage - multiplicité d'infection (MOI) - décrivant le rapport des particules de phage infectieuses au nombre de cellules hôtes dans un échantillon. Étant donné que certaines cellules adsorbent plus d'un phage alors que d'autres cellules n'adsorbent qu'un seul ou aucun phage, une population de cellules hôtes doit être infectée à une faible MOI (𢙁) pour minimiser la probabilité qu'une cellule soit infectée par plus d'un phage particule. L'utilisation de l'unité formant plaque (pfu) comme définition fonctionnelle évite ces complications lors de l'exécution de comptages de plaques pour calculer le titre d'un stock de phages.

Comme représenté sur la Figure 12, la morphologie de la plaque varie pour différents phages. Certains phages génèrent de petites plaques (panneau A) tandis que d'autres donnent naissance à de grandes plaques (panneau B). Un certain nombre de variables affectent la taille de la plaque. Il y a des raisons techniques qui contribuent à cette variabilité. Par exemple, les milieux complets et la gélose dure et épaisse favorisent le développement de plaques plus grandes, car les cellules hôtes peuvent soutenir la croissance des phages pendant une période plus longue. Une densité de placage élevée de cellules hôtes (㸐 9 cfu par plaque) entraînera une réduction de la taille de la plaque. L'utilisation de concentrations plus faibles de gélose molle augmentera la vitesse de diffusion des particules de phage dans la gélose molle et augmentera ainsi la taille des plaques. Rappelez-vous que cette augmentation de la vitesse de diffusion peut se produire involontairement si les plaques de gélose dure ne sont pas complètement sèches, de sorte que la condensation ou l'excès d'humidité dans la boîte dilue la gélose molle dans le revêtement. Cette surveillance technique produira des résultats incohérents en ce qui concerne la taille de la plaque pour un phage particulier.

La taille de la plaque est également liée à un certain nombre d'événements de la cellule hôte, y compris l'efficacité de l'adsorption, la durée de la période de latence (la période de temps entre l'adsorption du phage et la lyse de la cellule hôte) et la taille de l'éclatement (le nombre de descendants libérés par une seule infection). Un mélange hétérogène de tailles de plaques peut être observé si les particules de phage infectent les cellules hôtes à différentes phases de croissance bactérienne. Par exemple, ceux qui s'adsorbent au début de la phase exponentielle forment des plaques plus grandes avec plus de phages descendants que ceux qui s'adsorbent à la fin de la phase exponentielle. En règle générale, les phages lytiques produisent des plaques claires tandis que les phages lysogènes forment des plaques troubles. Cependant, certains phages lytiques produisent des motifs intéressants tels que la plaque "en œil de bœuf" illustrée dans Figure 12B. Ces plaques claires sont entourées d'un halo trouble parce que les cellules au bord de la plaque ne sont pas complètement lysées ou peuvent être résistantes à l'infection par les phages. Un motif "en œil de bœuf" observé avec le phage tempéré est une plaque avec un centre trouble entouré d'un anneau clair. Cette morphologie reflète la MOI et la physiologie de la cellule hôte par rapport à la décision de lyse-lysogénie. Lorsque les cellules sont infectées pour la première fois par le phage, la MOI est faible et les cellules se développent rapidement car les nutriments sont abondants ensemble, ce qui facilite la croissance lytique. Au fur et à mesure que de plus en plus de cellules sont lysées, la MOI augmente et une plaque claire se forme. Les lysogènes au centre de la plaque, cependant, continuent de croître car ils sont immunisés contre la lyse donnant lieu à une plaque claire avec un centre trouble.

La technique de superposition peut être modifiée pour les tests de plaque avec des virus eucaryotes. De la même manière que les bactériophages forment des plaques sur un tapis de cellules bactériennes en gélose molle, les virus eucaryotes forment des plaques sur une monocouche de cellules recouverte d'un gel. Une monocouche est une feuille confluente de cellules poussant côte à côte à la surface d'une boîte de culture, se touchant mais ne poussant pas les unes sur les autres. Pour effectuer ce type d'analyse de plages, des aliquotes de virus sont ajoutées à des monocouches sensibles de cellules eucaryotes. Ensuite, la monocouche est recouverte d'un milieu nutritif à base d'agarose - ce gel limite la propagation des virus descendants libérés par les cellules infectées vers les cellules adjacentes de la monocouche. En conséquence, une zone sphérique, ou plaque, est produite qui contient des cellules endommagées par la libération de virions. Pour faciliter la visualisation des plaques, des colorants qui colorent les cellules vivantes peuvent être appliqués à la culture cellulaire en fournissant un contraste entre les cellules infectées et non infectées.

La technique de superposition de gélose molle est utilisée pour des expériences autres que les tests de plaque. Tout d'abord, il est important de se rappeler que la gélose nutritive dure est une matrice de support qui permet la croissance des bactéries. Deuxièmement, la gélose molle utilisée pour la superposition peut avoir une composition nutritive différente de celle de la gélose dure. De cette manière, la gélose molle peut servir de moyen pour tester les souches bactériennes pour diverses caractéristiques de croissance ou propriétés métaboliques. Par exemple, la technique de superposition est utilisée pour cribler les bactéries pour leur capacité à dégrader la cellulose (Teather et Wood 1982). Des colonies isolées sont cultivées sur un milieu gélosé dur non sélectif, puis de la gélose molle contenant 0,1 % (p/v) de carboxyméthylcellulose (CMC) est étalée sur la surface de la gélose dure. Après incubation, les plaques sont inondées de colorant qui permet de visualiser les zones d'éclaircissement autour des colonies dans la gélose molle. La clarification est provoquée par des enzymes hydrolytiques sécrétées par les bactéries décomposant la cellulose dans le milieu. Plus récemment, la technique de superposition a été utilisée pour détecter les bactéries qui inhibent la croissance des archées méthanogènes trouvées dans le rumen du bétail (Gilbert et al. 2010). Les isolats bactériens d'échantillons environnementaux sont cultivés sur un milieu nutritif gélosé dur, puis les colonies sont recouvertes de gélose molle contenant une culture de méthanogènes. Après incubation, les plaques sont inspectées pour les zones d'inhibition de croissance autour des colonies. Cette méthode identifie les souches bactériennes qui produisent des inhibiteurs des méthanogènes dans la gélose molle.

Les erreurs techniques les plus courantes qui se produisent avec la technique de superposition de gélose molle sont le versement de la gélose molle fondue lorsqu'elle est trop chaude ou trop froide. S'il fait trop chaud, les cellules bactériennes mélangées dans le milieu seront tuées avant le placage. S'il fait trop froid, la gélose molle formera des grumeaux lorsqu'elle sera versée sur la gélose dure. Dans les deux cas, les résultats seront au mieux ambigus ou illisibles.

Procédure de réplique. Le transfert de cultures d'un type de milieu nutritif à un autre pour tester les exigences de croissance devient assez laborieux s'il y a plus que quelques souches.Le placage de répliques est une méthode qui permet le criblage simultané d'un grand nombre de micro-organismes. Par exemple, après mutagénisation d'une culture de cellules de type sauvage, on peut étaler des dilutions sur plaque de la culture pour obtenir des plaques avec des colonies uniques. Les plaques primaires contiennent un milieu qui soutient la croissance de toutes les cellules, y compris les prototrophes de type sauvage, qui synthétisent tous les composés nécessaires à la croissance, et les auxotrophes mutants, qui portent une mutation génétique dans une voie biosynthétique les rendant incapables de synthétiser des composés particuliers essentiels à la croissance. En étalant le mélange de cellules sur un milieu complet, les nutriments manquants peuvent être récupérés dans l'environnement. Pour distinguer les prototrophes des auxotrophes, les colonies peuvent être répliquées sur un milieu minimal. Seuls les prototrophes pourront se développer. Parce que le modèle spatial de la plaque primaire est préservé, la comparaison de la plaque secondaire avec la plaque primaire permet l'identification des colonies mutantes. Pour déterminer quel composé les mutants ne sont plus capables de synthétiser, les colonies peuvent être répliquées sur des milieux minimaux complétés par des composés spécifiques (par exemple, des acides aminés, des sources de carbone, des vitamines, etc.). De cette façon, des centaines de colonies peuvent être criblées en même temps en utilisant la procédure de réplique sur plaque. Une erreur technique qui pourrait survenir est l'utilisation de plaques de gélose trop humides, provoquant l'étalement des colonies, contaminant toutes les cultures sur la plaque. Cela produit des résultats qui ne sont pas du tout fiables. Une autre erreur technique est d'appliquer trop de pression lors du transfert des cellules du velours aux plaques secondaires. Encore une fois, après incubation des plaques secondaires, les colonies résultantes peuvent se chevaucher, produisant des phénotypes de croissance attribués à la contamination plutôt qu'à l'auxotrophie.

Toutes les espèces microbiennes de type sauvage ne sont pas des prototrophes, de sorte que la procédure de réplication sur plaque peut être utilisée pour cribler simultanément différentes souches de type sauvage pour les exigences de croissance caractéristiques. Comme représenté sur la Figure 13, "dabs" de cellules de quatre Pseudomonas les souches bactériennes ont été étalées en double sur une plaque quadrillée contenant un milieu complet appelé YTA (panneau A). Les souches ont ensuite été répliquées sur trois plaques secondaires (panneaux B, C et D) composées de milieu minimal (MSA) additionné d'une source de carbone différente (acétamide, lactose et glycine, respectivement). Les résultats montrent que deux des quatre Pseudomonas souches (P. aeruginosa et P. stutzeri) sont incapables de croître sur ces trois sources de carbone. À titre de contrôle, les souches ont été répliquées sur une quatrième plaque avec du milieu YTA pour confirmer que les cellules ont été transférées tout au long de la procédure. Étant donné que les quatre souches poussent sur la plaque de contrôle YTA, les déficiences de croissance présentées sur les trois plaques précédentes de la série sont fiables. Les résultats de réplication-placage sont tabulés dans Tableau 1. Une erreur couramment commise consiste à interpréter une empreinte de croissance sur une plaque secondaire comme un résultat positif. Par exemple, comparez le phénotype de P. aeruginosa pour lequel P. stutzeri sur MSA + acétamide (panneau B). Cette dernière affiche une empreinte de croissance, ce qui est un résultat négatif, et peut se produire si les nutriments de la plaque précédente sont transférés avec les cellules mères. Aucune nouvelle croissance cellulaire ne se produit car les nutriments manquants ne sont pas disponibles pour les cellules de la descendance. Il est facile de confondre une empreinte avec une croissance réelle. En cas de doute, l'expérience doit être répétée à l'aide d'une méthode alternative telle que les cellules de strie-placage de la plaque primaire sur des supports secondaires.

Figure 1. Exemple de colonies isolées sur une plaque. Les sphères roses près du centre de la plaque sont des colonies de Serratia marcescens, une protéobactérie Gram négatif en forme de bâtonnet de la famille des entérobactéries. En raison de sa préférence pour les environnements humides, ce micro-organisme se développe couramment dans les coins des baignoires, dans les lavabos, dans les joints de carrelage et sur les rideaux de douche. S. marcescens est facile à reconnaître car il produit un pigment rougeâtre appelé prodigiosine. Les colonies sur cette plaque ont été générées en utilisant la technique de la plaque à stries, avec des colonies uniques apparaissant dans le quatrième quadrant après incubation à 30 ° C pendant 24 heures. Les trois autres quadrants montrent une croissance confluente dans laquelle les cellules déposées à la surface de la gélose se sont développées en colonies chevauchantes.

Figure 2. Instruments utilisés pour la technique de la plaque striée. De haut en bas, sont montrés des cure-dents (aplatis et non ronds), une boucle en fil métallique, une boucle en plastique jetable et des bâtons en bois. Les cure-dents sont généralement transférés dans un petit bécher en verre avec l'extrémité large vers le bas, puis recouverts de papier d'aluminium lorsqu'ils sont stérilisés à l'autoclave avant utilisation. Les bâtonnets de bois sont transférés dans des tubes à essai de 18 mm puis autoclavés pour être stérilisés avant utilisation.

Figure 3. (A) Technique de la plaque striée en utilisant la méthode du quadrant. Une boucle, un bâton ou un cure-dent pré-stérilisés est utilisé pour étaler l'échantillon sur un quart de la surface de la gélose avec un mouvement rapide et régulier de va-et-vient du bord au centre de la plaque. Cette action est répétée pour chacun des quatre quadrants de la plaque. Après incubation, la croissance cellulaire apparaît le long du trajet de l'instrument utilisé pour déposer les cellules sur la plaque. La séparation mécanique des cellules dans un échantillon mixte à l'aide de cette technique devrait donner lieu à des colonies uniques dans le quatrième quadrant (voir Figure 1 à titre d'exemple). Les colonies isolées sont appelées unités formant colonie (UFC). (B) Lorsqu'une boucle métallique est utilisée pour le placage de stries, elle doit être stérilisée à l'aide de la flamme d'un bec Bunsen avant le contact avec l'inoculum ou le milieu gélosé. Rappelons que la partie la plus chaude de la flamme est la pointe du cône bleu. En tenant la poignée de l'instrument, placez le fil dans la flamme à environ 3 à 4 pouces de la boucle. Laissez-le assez longtemps pour que le fil devienne rouge chaud. Déplacez le fil pour que la flamme s'approche de la boucle. Assurez-vous que la boucle métallique est refroidie avant de toucher l'inoculum.

Figure 4. Technique de la plaque de coulée. (A) Un petit volume d'échantillon (entre 0,1 et 1,0 ml) est distribué de manière aseptique dans une boîte de Pétri vide mais stérile à l'aide d'une pipette sérologique de 5,0 ml. (B) La gélose fondue équilibrée à une température d'environ 48 &# x000b0C est ensuite versée dans la boîte de Pétri avec l'échantillon. Après avoir fermé le couvercle, la plaque est doucement agitée pour mélanger l'échantillon et la gélose fondue. La gélose est laissée se solidifier pendant environ 30 minutes puis les plaques sont inversées pour l'incubation.

Figure 5. Technique de la plaque d'étalement avec un plateau tournant et un écarteur en verre. Une fois la plaque de gélose placée sur un plateau tournant, un petit volume d'échantillon (0,1 à 0,2 ml) est distribué de manière aseptique au centre de la plaque à l'aide d'une micropipette. L'épandeur est stérilisé en le plongeant dans un bécher d'éthanol puis en le passant à travers la flamme du bec Bunsen pour enflammer l'excès d'éthanol. Avant d'entrer en contact avec l'échantillon, l'épandeur doit être refroidi en le touchant à la gélose près du bord de la plaque. L'épandeur est doucement déplacé d'avant en arrière à travers l'échantillon à travers la plaque tandis que le plateau tournant tourne lentement. Cette action permet un étalement progressif mais uniforme de l'échantillon sur la surface de la gélose. Après avoir fermé le couvercle, la plaque doit être posée sur la paillasse sans être dérangée pendant au moins 5 minutes pour permettre à l'échantillon de s'absorber complètement dans la gélose avant d'inverser la plaque pour l'incubation.

Figure 6. Technique de la plaque étalée avec des billes de verre (méthode Copacabana). Des billes de verre qui ont été pré-stérilisées dans un autoclave sont versées sur la surface d'une plaque de gélose posée sur la paillasse. Un petit volume d'échantillon (100 à 150 μl) est distribué de manière aseptique au centre de la gélose à l'aide d'une micropipette. Avec le couvercle de la plaque fermé, un mouvement d'agitation horizontal est utilisé pour déplacer doucement les billes d'avant en arrière sur la plaque 6 à 7 fois, étalant l'échantillon. Cette action est répétée après la rotation de la plaque 60°. Le mouvement de secousse est répété une troisième fois après une autre rotation de 60°. Une fois l'échantillon complètement absorbé dans le milieu gélosé, les billes sont versées dans un bécher contenant 10 % d'eau de Javel. Les plaques sont ensuite inversées pour l'incubation.

Figure 7. Technique de superposition de gélose molle utilisée pour isoler et dénombrer les phages en fonction de la formation de plaques (également appelée test de plaque). (A) La présence de phages peut être détectée sous forme de zones de compensation, ou de plaques, sur une suspension confluente de colonies bactériennes poussant dans la gélose molle. Le phage T4 est un phage virulent à ADN double brin qui infecte son hôte, Escherichia coli, provoquant la lyse des cellules hôtes et la libération de phages descendants. Après plusieurs cycles d'infection et de lyse, les voisins E. coli les cellules dans la zone immédiate entourant la cellule hôte infectée d'origine disparaissent en laissant une plaque contenant des milliards de particules de phage T4. Le phage T4 produit des plaques d'environ 1 mm de diamètre. Dans cette expérience, 200 μl d'une dilution 10 -5 d'un stock de 2 x 10 8 pfu/ml de phage T4 ont été mélangés avec environ 300 μl de E. coli cellules indicatrices préparées sous forme de culture aérée à croissance exponentielle à 37 ଌ. Le phage et les bactéries ont été ajoutés à un tube de gélose molle EHA, mélangés, puis versés sur la surface d'une plaque de gélose dure EHA. Notez qu'il n'était pas nécessaire de permettre aux phages et aux bactéries de s'adsorber avant le placage dans ce cas. Après avoir laissé la gélose molle se solidifier sans être dérangée pendant 20 minutes, les plaques ont été inversées et incubées à 37 ଌ pendant 24 heures. (B) En l'absence de particules de phage infectantes, la croissance bactérienne entraîne une suspension trouble de cellules dans la gélose molle dans laquelle les colonies discrètes ne sont pas visibles. Au lieu de cela, une pelouse uniforme de cellules bactériennes, dans ce cas E. coli, se forme sur toute la couche de gélose molle.

Figure 8. Préparation de la plaque primaire (master) avec des échantillons bactériens. Pour garder les échantillons organisés, le fond de la plaque peut être marqué dans une grille et les carrés résultants numérotés. Chaque échantillon peut se voir attribuer un carré sur la grille. Voici des exemples de schémas d'inoculation corrects ou incorrects. Idéalement, un petit nombre de cellules est transféré au centre du carré à l'aide d'un outil d'inoculation stérile tel qu'un cure-dent pour « tamponner » l'échantillon (cellule n°4). Les erreurs d'inoculation courantes, telles que celles décrites dans la cellule n° 5 ("patch") et la cellule n° 6 ("remplissage"), entraînent une prolifération d'échantillons bactériens après l'incubation, contaminant par conséquent les carrés adjacents.

Graphique 9. Technique de plaque de réplique utilisée pour transférer des cellules des plaques primaires aux plaques secondaires pour les criblages phénotypiques. La marque sur la plaque primaire est alignée avec la marque sur le bloc recouvert de velours puis abaissée pour permettre à la surface de gélose d'entrer en contact avec le tissu. Les cellules sont transférées de la plaque au velours en appuyant légèrement mais uniformément sur la plaque primaire avec le bout des doigts. Cette action laissera une empreinte des échantillons de cellules sur le velours dans le même schéma spatial que la plaque primaire. La même procédure est utilisée pour transférer les cellules du velouté vers une plaque secondaire. Jusqu'à 7 à 8 plaques secondaires peuvent être inoculées en utilisant la même empreinte de plaque primaire sur le velours. La dernière plaque inoculée à partir du velours doit servir de contrôle positif. Il doit s'agir d'un milieu qui favorise la croissance de toutes les souches testées, garantissant un transfert cellulaire suffisant sur toute la série de plaques. Après l'incubation, les plaques secondaires peuvent être inspectées et notées pour la croissance par rapport à l'absence de croissance. Ainsi, plusieurs souches bactériennes peuvent être criblées simultanément sur plusieurs milieux de croissance en une seule expérience.

Figure 10. Exemple de résultat en utilisant la technique de la plaque de coulée. Un échantillon de 1,0 ml d'eau collecté dans une fontaine publique a été distribué dans une boîte de Pétri vide stérile. Ensuite, de l'YTA fondu mais refroidi a été versé dans la coupelle avec l'échantillon. La gélose contenait également 100 μg/ml de cycloheximide pour empêcher la croissance de levures et de moisissures qui auraient pu être présentes dans l'échantillon d'eau. Après avoir doucement agité pour mélanger, la plaque a été placée sur une surface plane et la gélose a été laissée se solidifier complètement. La plaque a été incubée à 37 ଌ pendant 48 heures. Montré est le résultat de cette expérience. Notez la différence d'apparence des colonies de surface, qui sont grandes et de forme circulaire, par rapport aux colonies de subsurface, qui sont très petites et de forme irrégulière car le milieu solidifié inhibe la propagation des colonies en subsurface.

Figure 11. Exemple de résultat en utilisant la technique de la plaque étalée. La "méthode de Copacabana" a été utilisée pour plaquer un mélange de cellules d'E. coli pour une expérience de criblage. Dans ce cas, le milieu de croissance (LB) contient du X-Gal, de sorte que les cellules exprimant une enzyme fonctionnelle β-galactosidase forment des colonies bleues tandis que les cellules présentant une mutation dans le lacZ gène et donc incapable d'exprimer une enzyme β-galactosidase fonctionnelle forment des colonies blanches. Souvent appelé "écran bleu/blanc", les deux types de colonies peuvent être facilement distingués l'un de l'autre sur la même plaque.

Figure 12. Exemple de résultat d'un test de plaque utilisant la technique de superposition de gélose molle. Montré sont des plaques formées sur la souche hôte Mycobactérie smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) par deux phages différents : (A) Mycobacteriophage Destroyers et (B) Mycobacteriophage MSSS. Ces phages ont été isolés par des étudiants du cours de laboratoire MIMG 103L de l'UCLA au printemps 2010. M. smegmatis est une Actinobactérie non pathogène et appartient à une famille de mycobactéries qui comprend quelques agents pathogènes connus pour causer des maladies graves telles que la tuberculose (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) et la lèpre (M. leprae). Environ 50 μl d'une dilution 10 -2 de Destroyers et une dilution 10 -3 de MSSS chacun ont été incubés avec 500 μl de M. smegmatis pendant 20 minutes à 37 ଌ puis mélangé avec du MBTA (soft agar) et versé sur des plaques MHA (hard agar). Après avoir laissé la gélose molle se solidifier sans être dérangée pendant 20 minutes, les plaques ont été inversées et incubées à 37 ଌ pendant 48 heures. Notez les morphologies de plaques distinctes produites par chaque phage. Les destroyers (A) forment de petites plaques (diamètre moyen d'environ 1 mm) claires caractéristiques d'un phage lytique tandis que le MSSS (B) développe de grandes plaques "en œil de bœuf" avec des centres clairs entourés d'un halo trouble (diamètre moyen d'environ 3,2 mm) . L'anneau brumeux peut être composé de bactéries résistantes à l'infection par les phages. Ce motif est distinct de celui formé par les phages lysogènes, qui produisent des plaques troubles.

Figure 13. Exemple de résultat utilisant la procédure de réplique sur plaque. Quatre Pseudomonas souches (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens et P. stutzeri) ont été testés en double pour la croissance sur trois sources de carbone différentes : acétamide, lactose et glycine. (A) La plaque primaire est un milieu complet (YTA) inoculé avec les quatre souches comme indiqué. Après incubation à 30 ଌ pendant 24 heures, les quatre souches se développent sur YTA. La plaque primaire a été utilisée pour répliquer la plaque sur un milieu minimal (MSA) complété par une seule source de carbone : acétamide (B), lactose (C) et glycine (D). La dernière plaque de la série était une plaque YTA témoin positif (E). Comme indiqué, les souches présentent des schémas de croissance variables après incubation sur les plaques secondaires. A noter qu'il est parfois difficile de faire la distinction entre croissance et empreinte de cellules. Par exemple, comparez l'empreinte générée par P. stutzeri sur les trois plaques MSA à aucune croissance sur les mêmes trois plaques par P. aeruginosa. Les deux sont des résultats négatifs par rapport aux modèles de croissance présentés par P. putida et P. fluorescens. Cependant, toutes les souches se développent sur la plaque témoin positive, confirmant que les cellules ont été transférées dans toutes les plaques secondaires de la série. Les résultats de cette expérience sont présentés dans Tableau 1.

 YTA (primaire)MSA + acétamideMSA + lactoseMSA + glycineYTA (contrôle)
P. aeruginosa+---+
P. putida+++++
P. fluorescens+++++
P. stutzeri+---+

Tableau 1. Résumé des résultats de placage de réplique. Croissance indiquée par le signe plus (+) et aucune croissance représentée par le signe moins (-). YTA est un milieu complet (gélose tryptone à la levure) et MSA est un milieu minimal (gélose aux sels minimaux). Les plaques MSA ont été complétées par une seule source de carbone comme indiqué.


Discussion

Les interactions d'échange métabolique se produisent fréquemment entre les cellules qui se développent à proximité les unes des autres, car les métabolites sont constamment libérés des cellules pour différentes raisons, telles que le métabolisme de débordement, la réparation des métabolites, ainsi que l'exportation de métabolites pour faciliter l'échange de métabolites . Chez les bactéries, un sous-ensemble de tels échanges de métabolites est de nature coopérative dans le sens où tous les partenaires d'échange profitent de cette situation (Oliveira et al., 2014), alors que pour la majorité des organismes eucaryotes, les stratégies d'échange de métabolites restent floues. Bien que les auxotrophes de levure soient viables dans des milieux enrichis et enrichis (Mülleder et al., 2012), en l'absence de supplémentation en acides aminés, ils ne parviennent pas à compléter les déficiences métaboliques dans plusieurs paires ou des expériences de co-culture d'ordre supérieur (Figure 1A, B , [Müller et al., 2014 Shou et al., 2007]), une nette différence avec les études bactériennes, où des expériences similaires étaient efficaces (Foster et Bell, 2012 Freilich et al., 2011 Harcombe, 2010 Pande et al. ., 2014 Ramsey et al., 2011 Vetsigian et al., 2011). Cela a conduit à des spéculations selon lesquelles la levure pourrait, contrairement à de nombreuses espèces bactériennes, ne pas avoir les capacités d'exportation requises pour permettre un échange pertinent de croissance de métabolites intermédiaires tels que les acides aminés et les nucléobases (Shou et al., 2007). En analysant l'exométabolome intra-colonie, nous avons cependant pu détecter les métabolites requis. En fait, nous avons constaté que les cellules d'une colonie sont entourées d'un riche exométabolome. Nous avons également constaté que la levure exploiterait efficacement les nutriments lorsqu'ils sont disponibles, dans la mesure où ils dépendent uniquement de ces métabolites extracellulaires. Ce résultat impliquait que l'échange de métabolites entre les cellules de levure en co-croissance est fréquent par nature, le manque de complémentation dans les expériences de co-culture pourrait donc refléter une limite de l'expérience elle-même, et ne pas représenter les capacités d'échange de métabolites des cellules de levure.

Pour éviter de combiner deux ou plusieurs cultures, nous avons choisi une approche de biologie synthétique et exploité la perte stochastique de plasmides pour introduire progressivement les déficiences métaboliques en combinaison aléatoire à partir d'une cellule initialement unique. La perte progressive de prototrophie a permis aux cellules de maintenir la croissance cellulaire sur la base de l'échange de métabolites, résultant en une communauté avec 73% d'auxotrophie, qui a augmenté à 97% lors de la supplémentation avec le métabolite le plus limitant, l'uracile. Malgré sa composition auxotrophe dominante, la communauté SeMeCo pourrait maintenir un exométabolome de type sauvage, une efficacité métabolique ainsi qu'une viabilité cellulaire, ce qui implique que ce type de coopération est une propriété physiologique robuste. Par conséquent, les capacités d'exportation et d'importation de métabolites naturels de la levure sont tout à fait suffisantes pour soutenir la co-croissance sur la base de l'échange de métabolites.

L'établissement de SeMeCos n'a pas non plus été facilité par le mélange des auxotrophes dans une combinaison d'ordre supérieur. Ceci est cohérent avec l'idée que la perte de plus de gènes métaboliques réduit les capacités biochimiques et n'en ajoute pas de nouveaux. La clé du système SeMeCo est plutôt de permettre l'auto-établissement progressif de la communauté à partir de la cellule unique ( Figure 2 ). Les systèmes de régulation de la rétroaction métabolique n'inhibent donc pas l'exportation des métabolites en général, mais empêchent la co-croissance coopérative lorsque des co-cultures déjà préétablies sont mélangées (Müller et al., 2014 Shou et al., 2007). Un rôle possible de ces mécanismes pourrait peut-être empêcher la propagation de cellules étrangères, potentiellement trompeuses, qui dérivent d'une colonie de levures concurrente. Nous pourrions reproduire un comportement qui est en faveur d'une telle hypothèse En injectant dans SeMeCo une culture cellulaire possédant le même génotype qu'un (HIS3 LEU2 ura3&# x00394 MET15) et rares (his3Δ leu2Δ URA3 MET15) génotype ( Figure 5A ), nous avons observé que les deux génotypes étaient rapidement épuisés par rapport au SeMeCo préétabli, quelle que soit la fréquence du génotype respectif dans SeMeCo ( Figure 5 & # x02014figure supplément 1).

L'étude de la composition génotypique de SeMeCo impliquait qu'il existe un ensemble défini d'interactions sous-jacentes aux propriétés de la communauté coopérante, qui a maintenu une composition de population similaire impliquant huit métabotypes concentrés de manière reproductible lorsqu'ils sont établis indépendamment. Cela indique que cette composition de communauté définie quantitativement était la plus efficace dans la coopération métabolique. Cette découverte peut combler une lacune importante dans la compréhension de l'évolution de la multicellularité Si une composition définie est la plus efficace dans la croissance coopérative, un avantage de sélection pourrait être fourni par toute sorte de liaison physique qui peut maintenir les partenaires de coopération dans les équilibres définis, en outre, fournir une protection supplémentaire contre l'invasion des types de cellules tricheries. En effet, les données sur l'exométabolome impliquent que le nombre d'interactions d'échange de métabolites entre les cellules en co-croissance pourrait être important. L'exométabolome de la colonie contenait une vaste gamme de biomolécules, dont la majorité des acides aminés ( figure 1C ) (Castrillo et al., 2007 Paczia et al., 2012 Silva et Northen, 2015). La découverte que les cellules de levure préfèrent l'absorption à la synthèse d'acides aminés et d'uracile, même lorsqu'elles sont génétiquement prototrophes, montre que les interactions d'échange s'établiront facilement une fois que l'environnement cellulaire aura acquis une concentration critique de métabolites. Cela a des implications pour l'interprétation des études métagénomiques et des expériences de tricherie/bienfaiteur, car pour cette raison, on ne peut pas conclure de la présence ou de l'absence génétique d'une seule voie métabolique, ou de la synthèse d'un seul métabolite, combien d'autres métabolites sont également échangés.

Même sans pression sélective, les levures de type sauvage et les levures de type sauvage ont établi un exométabolome riche en acides aminés sur un support minimal (figure 1C) et se sont engagées dans l'absorption des métabolites lorsque les nutriments étaient disponibles (figure 1E). Cela implique que ces caractéristiques sont une propriété naturelle de la levure et soulève la question de savoir pourquoi les communautés de levures naturelles ne sont pas composées d'auxotrophes génétiques de co-croissance. Pour répondre à cette question, il faut garder à l'esprit que posséder des gènes métaboliques dans le génome n'équivaut pas à une voie constamment active. Être génétiquement prototrophe donne donc un niveau plus élevé de flexibilité métabolique, car les cellules prototrophes peuvent réactiver une voie de synthèse si nécessaire. Contrairement à SeMeCo, le génotype d'une cellule dans une communauté naturelle ne reflète pas essentiellement son métabotype ou son rôle métabolique dans la communauté. De plus, le cycle de vie naturel de la levure implique la formation d'endospores, qui sont importantes pour résister à la famine, et pour se propager entre les habitats. Sans génotype prototrophe, une seule spore ne peut plus établir une colonie à elle seule car l'auxotrophie génétique interromprait le cycle de vie de la levure. Deuxièmement, seule une fraction du cycle de vie naturel de la levure se produit sous une croissance exponentielle qui nécessite un apport abondant en glucides et en azote. Le maintien d'un génotype prototrophe à la fois dans S. pombe et en S. cerevisiae sauvages (Jeffares et al., 2015 Liti et al., 2009) est donc entièrement compatible avec la présence de mécanismes élaborés d'échange d'acides aminés et de nucléotides.

La découverte que ces cellules passent complètement de l'autosynthèse à l'absorption d'histidine, de leucine, de méthionine et d'uracile, une fois ces métabolites fournis, a des implications directes sur la recherche utilisant la levure, un organisme modèle eucaryote primaire dans les études à l'échelle du génome. Une majorité d'expériences génétiques de levure sont menées dans des souches auxotrophes, nécessitant des compositions enrichies en acides aminés ou en milieu riche. Des parties importantes du métabolisme biosynthétique (la biosynthèse des acides aminés peut représenter jusqu'à 50 % du flux métabolique vers la biomasse) peuvent ainsi être restées silencieuses dans un nombre important d'expériences de génomique fonctionnelle. Les effets des interactions métaboliques et génétiques sur la physiologie cellulaire pourraient ainsi largement dépasser nos connaissances actuelles et pourraient être découverts lors du passage à des suppléments nutritionnels minimaux. Dans ce contexte, les SeMeCos sont simples à manipuler, à établir rapidement et sont faciles à analyser, et représentent donc un système modèle eucaryote efficace et largement applicable pour étudier à la fois la coopérativité et les effets du métabolisme en laboratoire.

En résumé, en utilisant l'histidine, la leucine, la méthionine et l'uracile comme voies métaboliques modèles pour les métabolites échangeables, nous avons constaté que S. cerevisiae les cellules préfèrent l'absorption de ces nutriments à leur auto-synthèse et maintiennent un exométabolome riche en acides aminés dans l'espace de la colonie extracellulaire, des indicateurs d'échange de métabolites intercellulaires en cours. Bien que la levure soit connue pour ne pas compenser l'auxotrophie dans les expériences de co-culture par paires et d'ordre supérieur, les cellules ont réussi à entrer dans la croissance coopérative métabolique en exploitant la ségrégation stochastique des plasmides de sorte qu'une seule cellule pourrait progressivement se transformer en une communauté hétérogène complexe. Composées de types de cellules auxotrophes qui ne sont pas viables par elles-mêmes, les communautés SeMCo ont pu surmonter les déficiences métaboliques et maintenir des concentrations de métabolites et une robustesse similaires à celles des cellules de type sauvage. De plus, la coopération avait imposé différents rôles métaboliques aux cellules contributrices. La formation progressive de la communauté révèle ainsi que la levure possède la pleine capacité d'échanger des métabolites anabolisants à des quantités pertinentes pour la croissance et établit facilement un métabolisme non cellulaire autonome au sein de structures communautaires complexes mais définies.


  • Ingrédients de la recette média (voir la page Recettes média)
  • boîtes de Pétri stériles en polystyrène. 100 x 15 mm est la taille la plus courante, mais les tailles 60 et 35 mm fonctionnent également
  • récipient en verre qui contiendra au moins deux fois le volume de vos médias
  • du papier d'aluminium pour couvrir votre contenant de média, ou une pellicule plastique si vous utilisez un micro-ondes
  • autoclave, autocuiseur, micro-ondes ou plaque chauffante pour stériliser vos milieux (voir la page Stériliser les liquides)
  • gants résistants à la chaleur, mains chaudes ou maniques pour la manipulation de récipients chauds
  • 70% d'alcool éthylique ou isopropylique (à friction)
  • nettoyant ménager, eau de Javel à 10 % ou lingettes désinfectantes pour nettoyer votre espace de travail
  • éprouvette graduée pour mesurer l'eau
  • balance pour peser des ingrédients solides
  • outils pour manipuler des ingrédients solides (tels que des bateaux de pesée et des pelles, ou des assiettes et des cuillères en carton)

Notes de biologie sur les mutations inverses | La génétique

L'article mentionné ci-dessous fournit des notes sur la mutation inverse.

Lorsqu'une mutation change le génotype normal de type sauvage en un type mutant, comme c'est le plus souvent le cas, l'événement est appelé mutation directe. Ceci contraste avec les mutations inverses dans lesquelles le génotype mutant devient le type sauvage d'origine. Dans les micro-organismes, les auxotrophes redevenant prototrophes sont facilement détectés en étalant les cellules de la souche auxotrophe à l'origine sur un milieu minimal.

Dans le bactériophage T4, les mutants rll (souches qui provoquent une lyse rapide des cellules hôtes) reviennent fréquemment à la souche rll+ de type sauvage. Chez la drosophile, un certain nombre de gènes mutants récessifs sont connus pour revenir au type sauvage, mais avec une fréquence moindre que les mutations directes. La capacité des gènes mutants à revenir suggère que la mutation, au moins dans certains cas, n'est pas un processus permanent et irréversible.

Les mutations inverses peuvent se produire de différentes manières. Dans une véritable mutation inverse, la séquence de paires de bases d'origine du type sauvage peut être restaurée. Ainsi, si une paire GC de la séquence de type sauvage est remplacée par une paire AT pour produire une mutation directe, une véritable mutation inverse pourrait à nouveau substituer une paire GC dans cette position.

Parfois, une paire de bases différente peut être insérée au site de la paire altérée qui a produit la mutation directe. Ainsi, lorsque GC est remplacé par AT, la réversion peut être due à une substitution par CG au lieu de GC. Cela produit un phénotype inverse même si sa séquence diffère du type sauvage par une seule paire de bases.

Parfois, une mutation apparemment inverse est due à une seconde mutation suppressive qui supprime l'effet de la mutation primaire de sorte que le phénotype apparaît comme le type sauvage. Il peut y avoir suppression intragénique lorsque la deuxième mutation se produit dans le gène portant la première mutation mais dans un site différent. Ou la suppression peut être intergénique (extragénique) lorsque la seconde mutation réside dans un gène différent.

Dans les deux types de suppression, la seconde mutation suppressive produit des produits fonctionnels du gène qui porte la première ou la mutation primaire. Par exemple, supposons que le gène A ne soit pas capable de produire une protéine A en raison d'une mutation. Une mutation suppressive dans le même gène ou dans un gène différent pourrait entraîner la production d'une protéine A, inversant ainsi la mutation dans le gène A.

Dans le cas de la suppression intergénique, le terme gène suppresseur désigne le gène qui a la seconde mutation supprimant la mutation primaire dans un autre gène. Les produits des gènes suppresseurs sont généralement des composants du système de traduction, les molécules suppressives sont fréquemment des molécules d'ARNt.

Dans la suppression intragénique, le retour au phénotype normal peut être provoqué par la délétion et l'insertion de nucléotides uniques dans le même gène. Ainsi, si le cadre de lecture des triplets est déplacé en raison d'une seule délétion provoquant une mutation primaire, le cadre serait restauré si une seule insertion se produit au site de la seconde mutation.

Seuls les triplets entre la délétion et l'insertion ajouteraient des acides aminés incorrects, le reste de la chaîne serait normal. Si le site de la seconde mutation est proche du premier, le nombre de mauvais acides aminés serait faible et une protéine fonctionnelle complète serait produite.

La suppression intergénique par les gènes suppresseurs est due à des changements dans le processus de traduction. La plupart des gènes suppresseurs résultent de mutations dans les gènes d'ARNt et leurs produits sont des molécules d'ARNt mutantes. Il existe des gènes suppresseurs de mutations dans chacun des trois codons de terminaison de chaîne, à savoir l'ambre (UAG), l'ocre (UAA) et l'opale (UGA).

Normalement, l'ambre, l'ocre et l'opale sont des mutations non-sens situées sur des sites dans un message et entraînent des fragments de chaînes polypeptidiques. Le gène suppresseur pour chaque mutation non-sens permet l'insertion d'un acide aminé au site du codon non-sens et la chaîne n'est pas terminée. La suppression des mutants de terminaison de chaîne est provoquée par la lecture du codon non-sens comme s'il s'agissait d'un codon sens.

Par exemple, un type de suppresseur d'ambre insère l'acide aminé tyrosine contre le codon non-sens UAG. Le gène suppresseur produit un ARNt spécifique de la tyrosine mutant. L'ARNt tyrosine normal a l'anticodon GUA et reconnaît les triplets UAC et UAU dans l'ARNm. L'anticodon dans l'ARNt mutant est changé en CUA qui s'apparie avec UAG et la tyrosine est insérée au lieu de la fin de chaîne précoce.

Un autre exemple illustre la suppression intergénique dans E. coli. Une mutation ambre primaire dans E. coli avait changé un triplet de base en un codon non-sens UAG. Certaines autres cellules d'E. coli portant la même mutation présentaient une mutation suppressive intergénique de l'ambre dans un gène codant pour l'ARNt de la sérine.

Le gène suppresseur a produit des molécules d'ARNt mutantes avec un anticodon altéré qui pourrait reconnaître AUG. Ainsi, le gène suppresseur pourrait insérer la sérine au site du triplet non-sens AUG et des chaînes polypeptidiques complètes pourraient être formées. Les suppresseurs UAG et UGA agissent en modifiant l'anticodon dans un ARNt spécifique et en produisant des ARNt suppresseurs mutants. Le mécanisme de suppression de la SAU n'est pas entièrement connu.

Le gène suppresseur d'ambre expliquait également l'apparition de mutants conditionnels dans le bactériophage T4. Les mutants ambrés de T4 se sont avérés se développer sur une souche d'E. coli (appelée hôte permissif) mais pas dans une autre souche (appelée hôte restrictif).

C'était parce que la souche permissive d'E. coli portait le gène suppresseur de l'ambre qui a inversé l'effet de la mutation de l'ambre. Les cellules d'E. coli qui n'ont pas le gène suppresseur d'ambre présentent également la mutation ambre.


Comment les Auxotrophes sont-ils identifiés dans une expérience de placage de répliques ?

Cliquez pour lire la réponse complète. Alors, comment faites-vous le placage de réplique?

La technique consiste à presser un disque recouvert de velours, puis à imprimer des plaques secondaires avec des cellules en colonies retirées de l'original assiette par le matériel. Généralement, un grand nombre de colonies (environ 30-300) sont réplique plaquée en raison de la difficulté à rayer chacun individuellement sur un assiette.

Sachez également, qu'est-ce qu'un marqueur auxotrophe ? Un marqueur auxotrophe est alors défini comme un allèle de type sauvage d'un gène qui code une enzyme clé pour la production d'un monomère essentiel utilisé dans la biosynthèse, Quelques exemples de la méthode couramment utilisée marqueurs auxotrophes chez S. cerevisiae sont URA3, LYS2, LEU2, TRI1, HIS3, MET15 et ADE2 (1).

Par conséquent, qu'est-ce que l'auxotrophe et le prototrophe?

&xiά&nu&omega "augmenter" &tau&rho&omicron&phiή "nourriture") est l'incapacité d'un organisme à synthétiser un composé organique particulier nécessaire à sa croissance (tel que défini par l'IUPAC). Un auxotrophe est un organisme qui présente cette caractéristique auxotrophe est l'adjectif correspondant.

Comment distingueriez-vous les auxotrophes et les prototrophes dans une population bactérienne ?

Un auxotrophe nécessite un facteur de croissance organique, mais une prototrophe ne le fait pas car il peut synthétiser tous les facteurs de croissance organiques dont il a besoin.


Voir la vidéo: Tout sur les milieux de culture en bactériologie médicale (Février 2023).