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Mesurer la densité des antigènes de surface

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J'essaie d'avoir une idée de la variété des méthodes utilisées pour déterminer le nombre d'antigènes et de récepteurs de surface cellulaire. Ceci est notamment différent de la détermination de l'affinité de ces marqueurs de surface.


Voulez-vous compter le nombre d'antigènes et de récepteurs dans les cellules vivantes ?

Voies possibles :

  1. FRET (peu susceptible de fonctionner)
  2. imagerie des récepteurs avec une résolution moléculaire unique
  3. Western blot pour estimer approximativement la quantité de récepteurs
  4. techniques de protéomique unicellulaire (peu adaptées)

Université Roy J. Carver de l'Illinois Centre de biotechnologie

La cytométrie en flux quantitative (QCFM) peut être utilisée pour analyser de grandes quantités de cellules pour plusieurs antigènes et pour quantifier le nombre de sites de liaison par cellule. La fonction linéaire représente la relation entre l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) des cellules qui ont été marquées avec un fluorochrome qui a été attaché à un ligand ou à un anticorps monoclonal (mAb) et le nombre moyen de récepteurs/cellules ou le nombre moyen de sites de liaison mAb/cellule. Des billes calibrées spéciales sont utilisées pour générer une courbe standard qui convertit le MFI en équivalents moléculaires de fluorochrome soluble (MESF) en liant une quantité quantifiable d'anticorps (capacité de liaison d'anticorps - ABC). L'exemple ci-dessous montre la quantification d'anti-EGFR humain à la surface cellulaire de la lignée cellulaire de carcinome épidermoïde humain SQCCY1 avec DAKO QIFFIT® – photo obtenue de U.T.M.D. Site Web du parc scientifique du Anderson Cancer Center – Division de la recherche. Différentes populations de billes montrées dans l'image se lient à des quantités calibrées d'anticorps CD5-FITC. Ce kit mesure l'immunofluorescence indirectement.

Vous pouvez utiliser des séries de cinq populations de microsphères fluorescentes marquées avec des quantités variables de FITC ou d'autres fluorophores connus comme Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647, APC, Cy™5, PE-Cy™5, R-PE pour mesurer les niveaux d'expression de cellules. L'intensité de fluorescence est quantifiée par comparaison directe des mesures de fluorescence de fluorochromes purs avec celles de microsphères marquées en surface avec le même fluorochrome.

Un programme d'analyse GRATUIT (QuickCal® v.2.3) est fourni avec chaque kit pour vous aider à déterminer les niveaux d'expression des cellules, et également pour évaluer la linéarité de l'instrument et le seuil de détection. Le programme d'analyse peut être obtenu ICI et utilisé en entrant le numéro d'accès qui a été fourni avec vos normes.

Liens et informations utiles

Tous les travaux effectués par le Roy J. Carver Biotechnology Center (CBC) doivent être reconnus dans les publications savantes, les affiches et les présentations. Une juste reconnaissance nous permet de mesurer l'impact de notre travail et soutient nos initiatives dans l'obtention de financement parrainé. De plus, tout membre du personnel de CBC qui apporte une contribution intellectuelle ou expérimentale substantielle mérite d'être davantage reconnu en tant que co-auteur.


Résumé

L'adsorption interfaciale d'un anticorps monoclonal de souris (type IgG1, anti-β-hCG) à l'interface hydrophile oxyde de silicium/eau a été étudiée par ellipsométrie spectroscopique et réflexion neutronique, suivie par l'évaluation de la liaison d'un antigène hormonal, la gonadotrophine chorionique humaine (hCG ), sur les molécules d'anticorps adsorbées. La quantité d'adsorption a atteint un maximum autour du pH isoélectrique (IP) de 6 pour l'anticorps, ce schéma dépendant du pH pourrait être modifié en augmentant la concentration en sel, une tendance également observée pour d'autres protéines. La réflexion des neutrons a révélé la formation d'une couche uniforme de 40 Â à partir de l'anticorps adsorbé, indiquant une orientation à plat. La liaison de hCG subséquente a montré que le rapport molaire de hCG lié à l'anticorps à l'interface était aussi élevé que 0,7 à faible couverture de surface de l'anticorps et diminuait avec l'augmentation de la concentration d'anticorps de surface. Les résultats indiquent une étendue croissante de l'encombrement stérique à l'accès à l'hCG avec l'augmentation de la densité de tassement des molécules d'anticorps sur la surface. Une comparaison avec des études de structure cristalline précédemment publiées suggère une torsion de la région variable pour permettre l'accès de l'antigène. La liaison de l'hCG s'est également avérée être dépendante du pH avec son maximum autour de l'IP, si la force ionique de la solution était faible (20 mM). Cependant, si la force ionique était augmentée à 200 mM, alors la liaison à l'hCG était influencée par une combinaison d'encombrement stérique et d'interaction électrostatique entre l'antigène et la surface. Ces résultats sont très pertinents pour l'amélioration des performances des biotechnologies telles que les tampons de test de fertilité et les biocapteurs basés sur l'immobilisation d'anticorps.

Auteur à qui la correspondance doit être adressée. Téléphone : 44-161-2003926. E-mail [e-mail protected]


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Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit un récepteur d'antigène conçu qui fournit un contrôle optique sur la signalisation intracellulaire dans les cellules T tout en étant conjugué à des cellules présentatrices d'antigène. Nous avons utilisé ce nouvel outil pour interroger directement la capacité du réseau intracellulaire à intégrer le signal des récepteurs antigéniques en quantifiant la persistance des stimuli à différents points de ce réseau. La principale conclusion de ce travail est que dans toutes les parties du réseau de signalisation intracellulaire testé, la perturbation de la signalisation des récepteurs d'antigènes a entraîné la dissipation de toutes les informations résiduelles au sein du réseau en 10 à 15 minutes. Cela renforce le point de vue selon lequel la signalisation proximale du TCR, et probablement de nombreux autres récepteurs des cellules immunitaires, doit être maintenue pendant de nombreuses heures pour entraîner une activation efficace, comme suggéré précédemment (Huppa et al, 2003 ), et nécessite probablement la présence de signaux de costimulation (Trendel et al, 2019). Néanmoins, nous avons pu observer directement la persistance de ce signal biochimique au sein du réseau au niveau de l'expression des gènes en utilisant des trains de signalisation pulsés. Nous avons également démontré qu'une signalisation proximale soutenue est nécessaire pour maintenir les facteurs de transcription dans un état actif, et donc l'expression génique continue, la désintégration de l'ARNm étant l'intermédiaire de signalisation le plus long ayant une demi-vie approximative entre 15 et 30 min pour les transcrits mesurés. ici. Nous avons ensuite démontré que cette persistance limitée du signal pouvait être exploitée pour augmenter la sortie efficace des cellules T lorsqu'elles étaient stimulées par un CAR anti-CD19 cliniquement pertinent via une signalisation pulsatile.

Nos résultats impliquent que les cellules T ne peuvent intégrer directement les signaux TCR sur plusieurs interactions APC dans une courte fenêtre temporelle. Comme indiqué ci-dessus, l'intervalle entre les interactions séquentielles lymphocytes T/APC peut être de 1,5 à 2 h (Gunzer et al, 2000 ), ce qui est incompatible même sur les échelles de temps que nous avons mesurées pour la persistance de l'ARNm. Cependant, il existe de bonnes preuves que les cellules T accumulent la production de l'expression des gènes sur de multiples interactions (Faroudi et al, 2003 Municipalité et al, 2005 Clark et al, 2011 ), ce qui suggère qu'un seuil d'expression protéique doit exister au-delà duquel la spécification de la fonction des cellules T se produit. En titrant l'amplitude de l'intensité du signal émanant de l'OptoCAR à l'aide d'un éclairage gradué, nous avons pu démontrer qu'un niveau minimal de signalisation est nécessaire pour piloter la sortie en aval de manière numérique, en accord avec cela. L'étude de Bousso et ses collègues (Clark et al, 2011) ont suggéré que l'accumulation de FOS activés était un mécanisme potentiel pour intégrer plusieurs événements de signalisation des lymphocytes T, où ils ont trouvé que le phospho-FOS T325 augmentait même lorsque la signalisation des récepteurs était perturbée. Cependant, ce résultat ne cadre pas avec la perte rapide de cette modification lorsque l'activité ERK est inhibée (Murphy et al, 2002), en accord avec notre conclusion selon laquelle l'activité FOS est rapidement perdue à l'arrêt de la signalisation (Fig 4F). Cette divergence peut résider dans la façon dont le FOS activé a été détecté ou dans l'utilisation de billes recouvertes d'anticorps pour activer les cellules T. Une limitation de notre approche OptoCAR, et pour les CAR en général, est qu'il peut y avoir d'autres interactions protéiques régies par les chaînes CD3 accessoires non présentes dans ces récepteurs chimériques qui pourraient aider à maintenir la signalisation même lorsqu'elles se dissocient du ligand.

Il y avait une corrélation claire entre la distance du réseau intermédiaire du récepteur d'activation et la diminution de la vitesse à laquelle les signaux étaient dissipés lors de la perturbation de la signalisation, en partie explicable par la transition des réactions de kinase basées sur Tyr à Ser/Thr. Cela suggère que la durée de la signalisation pourrait être codée par la persistance différentielle du signal au sein du réseau, l'expression des protéines étant le seul état pouvant persister sur l'échelle de temps. Étant donné que de nombreux réseaux de signalisation sont construits à partir d'étapes séquentielles, une meilleure « mémoire » de l'activation des récepteurs s'imprimerait lorsque des étapes plus distales sont stimulées. Cela aurait également pour effet de filtrer des impulsions de signalisation plus parasites, qui seraient incapables de surmonter efficacement plusieurs étapes et donc de se dissiper plus efficacement (Altan-Bonnet & Germain, 2005). Un corollaire important de ces conclusions est que, au moins pour celles que nous avons étudiées, les réactions opposées au sein du réseau de signalisation qui cherchent à rétablir le niveau basal de signalisation doivent être efficaces et puissantes, avec un flux de signalisation continu requis pour les surmonter. .

Des études antérieures ont étudié comment l'inhibition transitoire de la signalisation TCR affecte le niveau de flux de Ca 2+ et le taux de son déclin sur la perturbation du signal (Valitutti et al, 1995 Varma et al, 2006 Youséfi et al, 2019). Ces rapports ont trouvé une forte dépendance à la signalisation proximale du TCR pour maintenir le niveau accru d'ions Ca 2+ en accord avec nos résultats. Cependant, nous avons mesuré une diminution beaucoup plus rapide de cette lecture (Fig 2L), que nous attribuons à la façon dont nous perturbons la signalisation des récepteurs en étant plus directe et efficace. La diminution rapide de l'ERK phosphorylée sur la perturbation de la signalisation que nous avons observée (Fig 3E) a également été trouvée dans une autre étude optogénétique récente dans les cellules NIH3T3 (Bugaj et al, 2018), suggérant que les résultats que nous avons trouvés sont susceptibles d'être plus généralement applicables au-delà de la signalisation des cellules T. Notre découverte que l'état actif du facteur de transcription FOS, comme ERK, nécessitait une signalisation proximale continue implique que seule leur sortie en aval d'une expression génique accrue peut constituer un état persistant significatif de signalisation précédente pour ces TF. Cependant, nous n'impliquons pas que d'autres états persistants ne peuvent pas exister, tels que la migration ou l'activité cytotoxique via d'autres mécanismes. Cela signifie que l'encodage de la dynamique de signalisation via les TF devrait également être à ce niveau, et des études antérieures ont fourni des preuves de ce résultat (Murphy et al, 2002 Locasale, 2007 Clark et al, 2011 Marangoni et al, 2013 ).

Il y a eu plusieurs autres études utilisant l'optogénétique pour étudier comment la dynamique de signalisation influence l'activation cellulaire en aval, ce qui a conduit à de nouveaux résultats passionnants (Toettcher et al, 2013 Graziano et al, 2017 Wilson et al, 2017 Bugaj et al, 2018). Ces études ont invariablement utilisé la translocation médiée par la lumière d'une enzyme constitutivement active vers la membrane plasmique comme moyen de contrôler la signalisation en aval. Bien que très efficace, cette approche « court-circuite » la signalisation du récepteur en amont, contournant potentiellement des parties clés du réseau et supprimant toute information spatio-temporelle qui pourrait être codée dans l'activation physiologique du récepteur au sein des conjugués cellulaires. Dans notre approche, la lumière contrôle l'initiation même de la transduction du signal du récepteur sans altérer l'architecture du réseau, l'activation du récepteur se produisant dans le contexte physiologique d'une interface conjuguée lymphocyte T/cellule présentatrice. Nous pensons que cette approche fournit le contrôle le plus réaliste sur l'activation des récepteurs, sans perturber la signalisation des autres récepteurs de la surface cellulaire qui pourraient moduler l'entrée du TCR, comme la costimulation via l'engagement de CD28. Nous avons également étudié les composants de signalisation endogènes plutôt que les capteurs protéiques surexprimés, qui devraient rendre compte le plus fidèlement de la dynamique du réseau.

L'OptoCAR que nous avons développé dans ce travail contient trois motifs de signalisation ITAM. Bien qu'il soit capable d'initier une signalisation en aval très efficace, on ne peut pas s'attendre à ce qu'il reproduise entièrement tous les aspects du complexe TCR complet. Nous avons déjà montré que la paire récepteur/ligand orthogonale utilisée dans l'OptoCAR peut entraîner une ségrégation équivalente de la phosphatase CD45 qui est censée initier la signalisation du récepteur comme observé pour le TCR (James & Vale, 2012) ainsi que la signalisation en aval (James, 2018). Nous avons également montré que le nombre accru d'ITAM présents sur le TCR lui permet d'être très efficace pour transduire la liaison du ligand en un signal, même à faible taux d'occupation des récepteurs (James, 2018). Cependant, pour toutes les expériences réalisées dans ce travail, nous avons travaillé dans un régime d'occupation élevée en saturant avec le dimériseur, nous nous attendons donc à ce que l'OptoCAR, comme des constructions CAR similaires, fournisse un stimulus largement équivalent à celui attendu du TCR lui-même.

Nous avons utilisé la lignée cellulaire Jurkat pour la plupart de nos tests, qui est un modèle bien utilisé pour les études sur les cellules T (Abraham & Weiss, 2004 ) mais ne peut pas reproduire entièrement les fonctions des cellules CD4 + T primaires (Bartelt et al, 2009). Cependant, la mutation connue dans les cellules Jurkat dans la signalisation PI3K due à l'inactivation de PTEN (Shan et al, 2000) ne devrait pas avoir d'effet direct sur la dynamique des voies de signalisation étudiées dans cette étude. Nous sommes donc convaincus que les conclusions que nous avons tirées de nos ensembles de données sont susceptibles de se généraliser à d'autres réseaux de signalisation de récepteurs qui dépendent des mêmes voies de transduction.

En résumé, nous avons développé un récepteur d'antigène contrôlable optiquement pour quantifier la fenêtre temporelle sur laquelle les cellules T peuvent intégrer les signaux TCR entre les interactions APC successives et renforcer l'idée qu'une signalisation proximale soutenue est nécessaire pour une activation cellulaire puissante.


Outils pour améliorer la conception de votre panel - Détermination de la densité d'antigène

Lorsqu'un chercheur choisit d'utiliser la cytométrie en flux pour répondre à une question scientifique, il doit d'abord construire un panneau polychromatique qui tirera parti de la puissance de la technologie et de la conception expérimentale.

Lorsque nous nous apprêtons à utiliser la cytométrie en flux pour répondre à une question scientifique, nous devons concevoir un panel polychromatique qui nous permettra d'identifier les cellules d'intérêt - la cible de la recherche. Pour identifier ces cellules, nous devons construire un panel qui tire parti de la luminosité relative des fluorochromes, du niveau d'expression des différentes protéines sur la cellule et des performances de l'instrument, entre autres.

Dans sa forme la plus basique, le but est de maximiser la sensibilité de la mesure sur les cellules cibles. Nous y parvenons en associant des fluorochromes plus brillants à des cibles exprimées plus faibles, tout en minimisant la perte de résolution dans les canaux cibles.

L'une des premières étapes du processus consiste à classer le niveau d'expression des cibles sur les cellules des principaux marqueurs de sous-ensemble (CD3, CD4, CD19, etc.) aux cibles de notre enquête. Pour déterminer la réponse à ces questions, nous devons faire des recherches dans la littérature. Heureusement, il existe plusieurs ressources disponibles pour vous aider dans ce travail.

Le premier est le site Benchsci.com. Ce site Web utilise l'IA pour organiser les articles publiés, identifier les cibles, les clones, les cellules, les tests, etc. Lorsque vous recherchez une cible donnée, vous pouvez voir les données où elles ont été utilisées, ce qui vous permet de prendre une décision plus éclairée quant à l'utilité de la cible. Benchsci.com a également introduit un outil qui tire parti de son IA pour vous aider à sélectionner des réactifs pour votre recherche.

La deuxième ressource est une publication de Kalina et ses collègues (2019). Dans cet article, les auteurs ont mesuré les niveaux d'expression des antigènes CD de 1 à 100 sur 47 sous-ensembles de cellules immunitaires. Ils ont utilisé des anticorps marqués au PE pour calculer les niveaux d'expression. Toutes les données sont accessibles sur www.hcdm.com. Des exemples de données, offrant une vue d'ensemble des niveaux d'expression, sont illustrés à la figure 1.

Figure 1: Modèle d'expression de 29 antigènes CD à la surface de sous-ensembles de cellules immunitaires (en haut). La couleur indique l'intensité de l'expression, tandis que la taille des cercles représente la fréquence de la population dans le sous-ensemble donné.

La troisième ressource est un article d'Amir et ses collègues (2019). Ils ont utilisé la cytométrie de masse pour faire la même chose que Kalina et ses collègues ont fait en utilisant des marqueurs fluorescents. Dans cet article, les auteurs ont criblé 350 anticorps et utilisé la plateforme d'analyse automatisée Astrolabe. Les données, qui permettront au chercheur d'explorer ses antigènes cibles, sont disponibles sur ce site.

Figure 2: Modèle d'expression de différents antigènes dans divers sous-ensembles cellulaires (horizontal). La couleur représente l'intensité du signal et la taille du cercle représente le pourcentage de population positive.

Auparavant, la détermination du niveau d'expression de différents antigènes était une combinaison de conjectures et de travail de détective. Vous deviez lire plusieurs revues pour avoir une idée de ce que d'autres avaient publié, cela n'est devenu que plus complexe et plus long lorsque les antigènes ont commencé à avoir plusieurs clones. Entrez dans l'automatisation et l'intelligence artificielle sous les traits de Benchsci.com. Cet outil est une excellente ressource pour aider les chercheurs à identifier le clone approprié à utiliser pour leur travail.

De plus, deux groupes ont utilisé des approches différentes pour fournir à la communauté des chercheurs les outils nécessaires pour déterminer la densité d'antigène sur différents sous-ensembles cellulaires. Tous deux ont rendu leurs données accessibles au public afin que la communauté des chercheurs puisse tirer pleinement parti de ces ressources.

Ainsi, la première étape de la conception du panneau est passée de frustrante et ennuyeuse à une simple question de transformer votre navigateur Web en trois sites pour obtenir toutes les informations dont vous avez besoin. Dans le prochain blog sur la conception de panneaux, nous discuterons des similitudes et des différences entre la conception de panneaux pour la cytométrie en flux fluorescente traditionnelle et la cytométrie spectrale, avec une touche de cytométrie de masse pour faire bonne mesure.

Tim Bushnell est titulaire d'un doctorat en biologie du Rensselaer Polytechnic Institute. Il est co-fondateur et esprit didactique d'ExCyte, le leader mondial de la formation en cytométrie de flux, dont l'organisation dispose d'une véritable bibliothèque de ressources en laboratoire sur le séquençage, la microscopie et des sujets connexes dans les sciences de la vie.


Discussion

La reconnaissance différentielle de l'antigène par les BCR est reconnue depuis longtemps pour jouer un rôle clé dans deux phases spécifiques des réponses des lymphocytes B T-dépendants. Le premier est lorsque les cellules B au repos sont sélectionnées pour entrer dans la réponse car cela nécessite que l'interaction du BCR avec l'antigène étranger dépasse un seuil critique. Par la suite, les cellules B somatiquement mutées générées dans les GC ne sont propagées que si elles acquièrent une affinité accrue pour l'antigène présenté dans les complexes immuns sur les cellules dendritiques folliculaires. Entre ces deux points de contrôle, cependant, les cellules B répondantes doivent décider si elles doivent entrer dans la réaction GC ou subir une différenciation rapide des plasmocytes dans les foyers prolifératifs extrafolliculaires. Dans cette étude, nous démontrons que cette décision est également contrôlée par la nature de l'interaction entre le BCR et l'antigène. Ainsi, nous montrons que seuls les clones répondants qui subissent une forte interaction initiale avec l'antigène peuvent se différencier efficacement en plasmocytes extrafolliculaires et contribuer à la réponse précoce rapide des anticorps T-dépendants.

Les études réalisées ici ont nécessité la production et la purification de quantités de milligrammes des diverses protéines HEL recombinantes. Ceci a été réalisé en utilisant l'expression de levure et a donné des préparations de protéines qui étaient pures à plus de 95 %. Néanmoins, il existait la possibilité que des traces de produits dérivés de levure ayant des effets immunomodulateurs potentiels puissent influencer les résultats. Nous considérons que cela est très improbable pour plusieurs raisons. Premièrement, la réponse observée ici après provocation avec HEL WT -SRBC est indiscernable de celle obtenue lorsque l'HEL natif dérivé d'œufs de poule est conjugué à des SRBC (6). Deuxièmement, les réponses caractéristiques obtenues pour chacun des mutants HEL étaient cohérentes entre les lots de la même protéine purifiée (données non publiées). Enfin, lorsque les cellules B d'affinité élevée et intermédiaire répondaient de manière compétitive au même antigène chez le même hôte, les différences prédites dans la production de plasmocytes étaient toujours observées (Fig. 7). Ensemble, ces observations indiquent que nos résultats n'ont pas été affectés par la présence d'un contaminant potentiel de levure.

L'existence d'un seuil dépendant de l'antigène pour la production précoce de plasmocytes était initialement évidente dans cette étude à partir de l'absence sélective de la réponse extrafolliculaire lorsque SWHEL Les cellules B ont été provoquées avec la faible affinité (Kune d'environ 1,5 × 10 6 M -1 ) d'antigène HEL 3X -SRBC (figures 1, 3 et 4). Ce résultat contraste avec les résultats d'études antérieures sur les réponses des lymphocytes T-dépendants utilisant l'haptène chimique NP conjugué à la protéine porteuse de la -globuline de poulet (CGG) (NP-CGG). Dans ce système, les cellules B avec une gamme d'affinités anti-NP initiales n'ont montré aucune localisation différentielle aux foyers extrafolliculaires par rapport aux GC précoces (11, 30, 31). En effet, des affinités aussi faibles que 10 5 M -1 sont représentées de manière égale dans les foyers extrafolliculaires et les GC précoces générés après l'immunisation NP-CGG (11). Les résultats du système anti-NP ont conduit à la théorie selon laquelle la différenciation des cellules B répondantes le long des deux voies de réponse précoces est essentiellement un processus stochastique qui fonctionne indépendamment des différences de reconnaissance des antigènes (11, 32). Ce modèle prédit que la poussée initiale de production d'anticorps par les plasmocytes extrafolliculaires reflète les spécificités de tous les clones de cellules B recrutés dans la réponse et est donc principalement de faible affinité. Bien que ce soit effectivement le cas dans les réponses anti-NP (5, 7), l'analyse des réponses aux virus et aux épitopes de protéines naturelles indique que la poussée initiale de production d'anticorps contre l'antigène T-dépendant est souvent d'affinité relativement élevée (>10 7 M − 1 références 13-15).

Les exigences disparates pour une affinité antigénique élevée dans différentes réponses d'anticorps T-dépendantes peuvent être conciliées en reconnaissant que c'est la force de l'interaction entre l'antigène et le BCR qui est cruciale pour réguler ce processus, plutôt que l'affinité antigénique en soi. Cette notion a été confirmée dans la présente étude en montrant que SWHEL Les cellules B pouvaient produire des réponses rapides des plasmocytes et des anticorps à l'antigène HEL 3X -SRBC de faible affinité lorsque la densité de HEL 3X sur la surface SRBC était augmentée (Fig. 6). La présence de clones de faible affinité dans la réponse du foyer extrafolliculaire à NP-CGG s'explique donc facilement par la densité élevée d'épitopes sur cet antigène protéique hapténé, qui porte typiquement 16 groupes NP par monomère CGG (31). Nos résultats suggèrent donc que les cellules B qui reconnaissent les épitopes de faible affinité peuvent encore interagir suffisamment fortement avec l'antigène pour entrer dans la réponse focale extrafolliculaire, mais seulement si l'épitope est présent à une densité relativement élevée.

Lorsque la densité d'épitopes est maintenue constante, il est évident qu'une réduction de 50 fois de l'affinité antigénique (c.HEL Cellules B (Figs. 3–5, 4 5 ). De plus petits changements quantitatifs dans la force de l'interaction entre l'antigène et le BCR en abaissant la densité de HEL 2X ou en augmentant la densité de HEL 3X sur la surface du SRBC ont eu des effets significatifs mais moins absolus sur la réponse précoce des plasmocytes (Fig. 6 ). De même, SWHEL(H) Les cellules B qui se sont liées à HEL WT avec une affinité intermédiaire étaient capables de provoquer une réponse plasmocytaire réduite mais toujours clairement évidente au jour 5 (Fig. 7). Collectivement, ces résultats démontrent qu'il n'y a pas de seuil d'interaction précis entre l'antigène et le BCR qui détermine si oui ou non une différenciation précoce des plasmocytes se produira. Au contraire, dans une certaine plage de forces d'interaction, la taille relative de la réponse plasmocytaire précoce est directement liée à la force de cette interaction antigénique initiale.

Il est difficile d'évaluer si une forte interaction entre le BCR et l'antigène est universellement requise pour la formation de foyers extrafolliculaires sans étudier cette question directement en utilisant d'autres antigènes modèles. L'affinité relativement élevée de la réponse précoce des anticorps à plusieurs antigènes T-dépendants (13-15) est certainement compatible avec la régulation BCR-dépendante de la production de plasmocytes extrafolliculaires qui se produit également dans ces cas. Néanmoins, il est possible qu'un adjuvant ou d'autres facteurs modificateurs modifient la quantité ou la qualité des signaux indépendants du BCR délivrés aux cellules B répondantes par les cellules T et/ou les cellules dendritiques et que ceux-ci puissent à leur tour outrepasser les contrôles dépendants du BCR décrits dans le présent étudier. Il sera intéressant de tester cette possibilité à l'avenir en défiant SWHEL Cellules B avec les différentes protéines HEL mutantes sous des formes immunogènes alternatives.

Contrairement aux antigènes T-dépendants, les antigènes T-indépendants de type 2 (TI-2) tels que NP-Ficoll ne génèrent généralement qu'une réponse extrafolliculaire. Des GC abortives peuvent être générées, mais seulement si la dose d'antigène et la fréquence des précurseurs sont suffisamment élevées (33). Ce biais des réponses TI-2 vers la formation de foyer extrafolliculaire est également évident dans le SWHEL système. Ainsi, lorsque 10 4 SW de liaison HELHEL Les cellules B sont provoquées avec HEL WT -Ficoll, des plasmocytes extrafolliculaires à courte durée de vie sont générés mais pas des GC (données non publiées). Si les observations de réponses T-dépendantes dans la présente étude peuvent également être appliquées aux réponses TI-2, il est possible d'attribuer la capacité des antigènes TI-2 à susciter une forte réponse focale extrafolliculaire au fait que ces antigènes sont généralement hautement réticulant (34, 35) et donc susceptible d'interagir fortement avec le BCR. Dans ce cas, l'échec des antigènes TI-2 à générer efficacement des GC reflète très probablement l'importance de l'aide des lymphocytes T dans la potentialisation de la formation de GC. Alternativement, la force de l'engagement du BCR peut affecter différemment les réponses T-dépendantes et TI-2, potentiellement en raison de la modulation dans ce dernier cas par les co-stimuli délivrés par les molécules réceptrices CD21/35 ou Toll-like (36).

La découverte que les différences quantitatives dans la reconnaissance des antigènes régulent le destin des cellules au cours des premières réponses des cellules B dépendantes du T révèle un niveau de contrôle sophistiqué qui a vraisemblablement évolué pour optimiser le déploiement des clones de cellules B répondants. Lier la différenciation rapide des plasmocytes à une forte interaction initiale avec l'antigène signifie que les ressources substantielles nécessaires pour soutenir la différenciation des plasmocytes et la production ultérieure d'anticorps de haut niveau (37) sont consacrées uniquement aux clones ayant de bonnes chances de sécréter des anticorps biologiquement efficaces (38). Dans le cas d'épitopes paucivalents, cela signifie effectivement que seuls des anticorps d'affinité relativement élevée sont produits (Figs. 2-4, 34). Cependant, les épitopes présents à haute densité peuvent être efficacement neutralisés par des anticorps de plus faible affinité (39-41). Dans ces conditions spécifiques (par exemple, HEL 3X -SRBC haute densité), il est biologiquement logique que les cellules B de faible affinité soient autorisées dans la réponse des plasmocytes extrafolliculaires (Fig. 6). La régulation médiée par le BCR des réponses T-dépendantes précoces garantit également que les spécificités spécifiques à l'antigène qui apportent une contribution minimale à la réponse initiale des anticorps ne sont pas rejetées mais spécifiquement dirigées vers les GC. Ici, ils peuvent subir une maturation SHM et d'affinité et peuvent contribuer à de nouvelles spécificités efficaces à un stade ultérieur de la réponse. Ceci est illustré lorsque SWHEL Les cellules B sont confrontées à une densité intermédiaire HEL 3X -SRBC, où l'absence d'une réponse anticorps précoce (jour 5) (Fig. 5 C) est suivie de l'accumulation ultérieure d'anticorps anti-HEL 3X de haute affinité produits par des post-mutations somatiques. Cellules plasmatiques GC (données non publiées).

Le rôle critique d'une forte interaction antigène-BCR dans la différenciation précoce des plasmocytes in vivo est intrigant étant donné que les cellules B stimulées par des signaux dérivés des cellules T in vitro subissent une différenciation efficace des plasmocytes liée à la prolifération sans avoir besoin de ligature BCR (32). Cette dichotomie suggère que la différenciation des cellules B in vivo est influencée par des signaux supplémentaires qui, en l'absence d'une forte reconnaissance d'antigène, suppriment la voie de différenciation des plasmocytes par défaut. Étant donné que les cellules B répondantes peuvent proliférer et entrer dans la réponse GC sans subir une différenciation significative des plasmocytes (par exemple, réponse HEL 3X -SRBC), il est possible que le microenvironnement GC inhibe ce processus. Si cela est vrai, une forte interaction initiale entre le BCR et l'antigène peut permettre à au moins une proportion des cellules filles d'un clone répondant de contourner la GC et de subir une différenciation des plasmocytes. Le mécanisme spécifique impliqué n'est pas clair mais peut être basé sur des altérations induites par le BCR dans l'expression des récepteurs chimiotactiques qui facilitent la migration extrafolliculaire (1). Alternativement, une présentation plus efficace des peptides dérivés de l'antigène facilitée par une reconnaissance plus forte de l'antigène peut entraîner des différences quantitatives ou qualitatives dans l'apport d'aide aux lymphocytes T qui influencent la réponse ultérieure des lymphocytes B. Un indice potentiel pourrait résider dans le fait que l'abaissement progressif de l'affinité antigénique initiale a réduit le taux de prolifération des cellules anti-HEL B au cours des 64 premières heures de la réponse (Fig. 2). Il est donc possible que la réponse proliférative initiale puisse influencer la capacité des cellules répondantes à subir une différenciation plasmocytaire rapide. Dans ce cas, il est possible que les signaux délivrés indépendamment de l'interaction antigène-BCR mais avec le potentiel de modifier la prolifération des cellules B (par exemple, les ligands des récepteurs Toll-like) puissent également avoir un impact sur la taille de la réponse des plasmocytes extrafolliculaires. Des études utilisant le modèle décrit ici aideront à résoudre les mécanismes spécifiques impliqués et à caractériser davantage les signaux qui façonnent les réponses des cellules B in vivo. De telles informations sont très prometteuses pour le développement futur de nouvelles thérapies pour les maladies auto-immunes ainsi que pour l'optimisation des stratégies de vaccination.


Évaluation comparative de l'expression de CD19 et CD20 de surface sur les lymphomes à cellules B à partir de biopsies cliniques : implications pour les thérapies ciblées

Pedro Horna, Grzegorz Nowakowski, Jan Endell, Rainer Boxhammer Évaluation comparative de l'expression des CD19 et CD20 de surface sur les lymphomes à cellules B à partir de biopsies cliniques : implications pour les thérapies ciblées. Du sang 2019 134 (Supplément_1): 5345. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2019-129600

Fond: CD19 et CD20 sont des antigènes spécifiques de la lignée des cellules B exprimés à la surface cellulaire de la plupart des lymphomes à cellules B. Alors que CD20 est acquis au cours des derniers stades de la lymphogenèse des cellules B et est ensuite perdu lors de la différenciation en plasmocytes, l'expression de CD19 couvre tout le spectre de la genèse et de la maturation précoces des cellules B. CD20-targeting agents have been broadly integrated into the therapeutic armamentarium for B-cell lymphomas. More recently, CD19-targeting agents have emerged as promising alternatives with demonstrated therapeutic value. Given the imminent availability of both CD19 and CD20 targeted therapies, and potential for combinational approaches, we studied the surface expression of these antigens at the single-cell level on lymphoma cells and benign background lymphoid subsets from biopsy specimens.

Méthodes: Flow cytometric analysis (seven-color) was performed on biopsy specimens from 47 patients with newly diagnosed B-cell lymphomas, including diffuse large B-cell lymphoma (n=15), follicular lymphoma (n=15), marginal zone lymphoma (n=9), mantle cell lymphoma (n=9), Burkitt lymphoma (n=2), and unclassifiable low-grade B-cell lymphoma (n=2). Small lymphocytic lymphoma was intentionally excluded, given its well-described loss of CD20 expression. Biopsies from eight additional patients with persistent/recurrent B-cell lymphomas after anti-CD20 therapy (greater than 6 months after last dose) were also evaluated. Thresholds for CD19 or CD20 antigen positivity were defined for each case, based on the 95th percentile fluorescence intensity of the respective marker on tumor-infiltrating T-cells (internal negative control). In addition, CD19 or CD20 fluorescence intensities of tumor cells were normalized to background benign B-cells (internal positive control) using the median fluorescence ratio (MFR).

Résultats: Both CD19 and CD20 were highly expressed on CD20 treatment naïve tumor cells, with a slightly higher median percentage of positive tumor cells for CD19 (98%) compared with CD20 (93%) (p=0.003), and one case lacking CD20 expression. When compared with background benign B-cells, CD20 was frequently overexpressed on tumor cells (mean MFR=1.8), while CD19 expression was overall similar to background benign B-cells (mean MFR=0.9) (p=0.001). As the surface density of CD20 on benign B-cells is reportedly higher than CD19 (

20,000 molecules per cell, respectively), these findings are consistent with a higher density of surface CD20 than CD19 on most B-cell lymphomas. However, CD20 expression was more heterogeneous (within individual patient samples and across patients), with a higher median percentage of CD20-negative tumor events (median=0.5%, range=0-98%) compared with CD19-negative events (median=0%, range=0-28%) (p=0.003). Interestingly, expression of CD19 within the CD20-negative tumor subsets was largely preserved (mean % CD19-positive events=97.86%, min=40%). In addition, percentages of CD19/CD20 double-negative tumor events were very small (median=0%, range=0-4.9%), and only detectable in 15 cases (32%). Of eight additional cases studied post-anti-CD20 immunotherapy (6-84 months after last dose), the percentage of antigen-positive events by tumor cells was largely preserved for both CD19 (median=99.6%, range=93.5-100%) and CD20 (median=95.7%, range=55.6-100%), similar to the pre-therapy cohort.

Conclusion: CD19 and CD20 are both highly and consistently expressed in B-cell lymphomas. While CD20 has a higher average density of surface molecules per tumor cell, CD19 expression is more homogenous and is preserved in small CD20-negative tumor subsets and after anti-CD20 targeted therapy. These findings support the clinical evaluation of anti-CD19 immunotherapies and combinational therapies targeting both surface antigens.

Horna:MorphoSys AG: Research Funding. Nowakowski:Selvita: Membership on an entity's Board of Directors or advisory committees Celgene: Consultancy, Research Funding Bayer: Consultancy, Research Funding Curis: Research Funding F. Hoffmann-La Roche Ltd: Research Funding Genentech, Inc.: Research Funding MorphoSys: Consultancy, Research Funding NanoString: Research Funding. Endell:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties. Boxhammer:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties.


Discussion

In this paper we have introduced a coarse-grained model of immunoglobulin G (IgG) molecules, realized by fastening three ellipsoids with the proper aspect ratio together around a common hinge. The purpose of our study is to shed light on the role of the IgG flexibility and large size on its ability to bind to surface-absorbed antigens. Our coarse-grained (CG) model is conceived explicitly so as to reproduce the distributions of inter-domain angles measured by cryo-ET.

In our simulations, a large number of IgGs diffuse in a given volume and a binding equilibrium is reached with antigens adsorbed at a given density on the bottom surface. The equilibrium profiles of the surface concentrations of IgGs bound with one Fab and with both Fabs to the antigen-covered surface highlight the crucial role played by flexibility. When compared with antibodies frozen in an equilateral triangular configuration, fully flexible molecules demonstrate a much higher ability to bind with both Fabs. This is a direct result of a dynamic chercher process performed by the dangling second Fab of IgGs already bound with one arm. This capability of adapting to irregular antigen configurations is quenched in the rigid molecules, which are only able to bind bivalently when they happen to find two antigens lying at the appropriate distance matching their fixed Fab-Fab angular aperture.

In order to shed light on the observed binding equilibrium, we formulate a two-step kinetic model, where IgGs first bind from the bulk to the surface with one Fab (equilibrium dissociation constant ) and then double with the second Fab (equilibrium dissociation constant ). Importantly, our model not only includes the information on the au et désactivé rates, but also accounts explicitly for an important geometrical constraint, namely surface dépistage. IgGs are large molecules and excluded-volume interactions, especially in the proximity of the antigen-covered surface, prove extremely important. This effect is two-fold. On the one side, (i) IgGs diffusing in the bulk voir a number of available epitopes on the surface which is reduced with respect to the bare number of sites that are already occupied. In fact, a substantial number of non-bound antigens are nonetheless de facto unavailable as a result of the large size of IgGs bound in their proximity, which make them invisible to other antibodies in the bulk. Moreover, (ii) as a result of the IgG-IgG excluded-volume interactions at the surface, it turns out that the second Fab of a single-arm bound IgG always sees the face-value antigen concentration around, as it never gets to probe already occupied sites. These are too far away on average as a result of the effective repulsion among bound IgG molecules on the surface.

We conclude that the large and extremely flexible three-lobe conformation of IgGs is accurately designed to afford bivalent binding and at the same time take advantage of excluded-volume interactions to a maximum. This is probably the result of concurrent evolutive pressures towards smart antigen chasers capable of (i) bind strongly, c'est à dire. with two binding sites (ii) bind differentially, c'est à dire. bind to antigens of widely different sizes and (iii) bind optimally, c'est à dire. maximize the number of bound molecules at a given concentration of target density.

Our model is in excellent agreement with surface plasmon resonance experiments of IgGs binding to surface-adsorbed haptens. We establish very clearly that flexibility is essential to reproduce the experiments (see Fig 6(a)). Furthermore, our theory allows us to isolate the second binding as the key factor that makes flexible IgGs much more powerful antigen binders. In fact, the dissociation constant measured from our simulations for rigid IgGs is five times larger than for the flexible ones.

A striking confirmation that the equilibrium constant for the second binding is the key factor can be gained by studying the equilibrium fraction of bivalently bound molecules (or, equivalently, sites). Once plotted against the antigen surface concentration rescaled by the dissociation constant (see Fig 6(b)), the three models, flexible, rigid and ghost fall on the same curve as the experimental data (where we have used the experimental dissociation constant). This remarkable fact proves very neatly that such relatif measure conceals a great deal of the physics underlying the binding process.

The concealed information is instead conspicuous when one looks separately at the binding profiles, c'est à dire. the average number of single-Fab (N1) and double-Fab bound (N2) IgGs against antigen concentration ??. More precisely, the low-concentration regime turns out to be the same in the three models, namely N1??, N2?? 2 . At low antigen coverage, it makes no difference at all whether IgGs are able to stretch their second arm to get hold of neighboring haptens or whether they repel each other on the surface. Importantly, the low-?? regime fixes the two equilibrium constants and , but obviously bears no sign of the screening effect. At increasing values of ??, the telltale signs of surface screening emerge clearly. Fully flexible molecules take advantage of the combined effects of their flexibility and mutual repulsion, which essentially makes haptens within reach of the second Fab always unoccupied on average. On the contrary, rigid IgGs remain largely unable to bind with both arms, despite their mutual exclusion, while ghost molecules take full advantage of their invisibility to bind with two Fabs, unphysically outperforming fully flexible antibodies at high densities.

We stress that our model includes in a natural way the kinetic parameters (au et désactivé rates for the two binding events) and the key geometrical parameters. This is at variance with an existing model of IgGs binding to antigen-covered surfaces [33], which conceals the thermodynamic and geometrical information in one and the same parameter, namely an effective screening area. As such, our model provides a more accurate and valuable theoretical framework to interpret experimental profiles of antibodies binding to multi-valent surfaces in different contexts.


Measuring cell fluorescence using ImageJ¶

Repeat this step for the other cells in the field of view that you want to measure.

NB: Size is not important. If you want to be super accurate here take 3+ selections from around the cell.

  • Once you have finished, select all the data in the Results window and copy and paste into a new spreadsheet (or similar program)
  • Use this formula to calculate the corrected total cell fluorescence (CTCF).

CTCF = Integrated Density – (Area of selected cell X Mean fluorescence of background readings)

Notice that rounded up mitotic cells appear to have a much higher level of staining due to its smaller size concentrating the staining in a smaller space. If you used the raw integrated density you would have data suggesting that the flattened cell has less staining then the rounded up one, when in reality they have a similar level of fluorescence.

This method is based, with permission, on an original protocol from QBI, The University of Queensland, Australia.


Voir la vidéo: Comment calculer la densité dun solide? 3 minutes pour tout comprendre avec un exercice corrigé (Février 2023).