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Assemblage de virus in vitro

Assemblage de virus in vitro


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Les chercheurs sont-ils capables d'assembler des virus in vitro?

Par exemple, j'imagine qu'une bibliothèque de phage display peut être générée en jetant dans un tube à essai les protéines de capside (ou ce que vous avez) avec l'ADN pertinent qui s'auto-assemblera. Cela a-t-il été fait ? Si oui, est-ce une technique facilement applicable à un large éventail de virus ?


Oui, et une recherche rapide d'assemblage in vitro viral donnera des tonnes de résultats. - c'est un peu plus compliqué que ça ! - mais ce n'est généralement pas fait comme tel, ce que je vais expliquer. Fondamentalement, il y a quatre choses que vous pourriez vouloir faire :

  1. Vous voulez fabriquer de grandes quantités de virus et l'étudier. Si tel est le cas, tout ce que vous avez à faire est d'infecter votre culture cellulaire avec votre virus et de la laisser se répliquer. Certains sont évidemment plus faciles que d'autres - d'après ma propre expérience, le VIH est assez facile mais l'hépatite C est un vrai PITA - mais c'est essentiellement tout. Cela suppose évidemment que vous avez déjà un stock de virus sous la main pour l'infection. Vous pouvez également transfecter la culture avec des plasmides viraux complets, ce qui m'amène à…
  2. Vous voulez étudier un aspect spécifique du virus. C'est super! La plupart des gens ne se contentent pas de concocter un virus. En règle générale, pour les virus que les humains peuvent attraper, il est généralement recommandé/fortement encouragé de n'utiliser que ce dont vous avez besoin pour des raisons de sécurité. Ainsi, par exemple, vous pourriez transfecter la protéine que vous jugez importante pour voir ce qu'elle fait par elle-même. Après cela, vous pourriez transfecter la culture cellulaire avec le virus complet, mais avec un gène important inactivé. J'avais l'habitude de fabriquer du VIH à un tour en utilisant un plasmide pour le VIH complet sans gène d'enveloppe fonctionnel et un autre plasmide pour l'enveloppe du VSV ; de nouvelles particules de VIH seraient rendues infectieuses à cause du gène VSV, mais après avoir été infectées, elles n'avaient plus ce gène. En gros, une version limitée du virus, ce qui m'amène à…
  3. Vous voulez créer des particules ressemblant à des virus. Ce sont l'une des choses les mieux nommées en science et sont exactement ce à quoi elles ressemblent - des particules qui ressemblent beaucoup à des virus, mais qui ne le sont pas. Généralement, ce sont des coquilles vides. Nous pouvons les utiliser pour toutes sortes de choses, des études de vaccins à d'autres gènes et maladies. Les techniques peuvent varier, mais en général, c'est similaire à ce qui précède.
  4. Vous voulez présenter quelques autre gène à un système de culture cellulaire, en utilisant un squelette de virus pour la transduction; pensez "Je veux réparer ces cellules… de façon permanente." Généralement, ces virus sont généralement basés sur un adénovirus ou un lentivirus (alias VIH) car ils inséreront leurs gènes dans le génome de la cellule, de sorte que le gène persistera.

Le point 4 est probablement le plus proche de ce que vous vouliez dire spécifiquement. Voici une revue gratuite sur l'utilisation et la sécurité des vecteurs rétroviraux chez l'homme, et en voici une intéressante chez les poissons. Quant aux virus auxquels il s'applique, eh bien, cela varie beaucoup selon le virus, l'hôte, le système de culture, etc.


Assemblage in vitro de rétrovirus

L'assemblage, qui fait partie des derniers stades du cycle de vie rétroviral, commence lorsque la polyprotéine structurelle Gag s'associe à l'ARN génomique viral. En fin de compte, plus d'un millier de molécules Gag forment un virion sphérique immature. La maturation a lieu peu de temps après ou en même temps que le bourgeonnement du virus et est initiée lorsque Gag est clivé par la protéase rétrovirale en ses domaines protéiques constitutifs. On pense que le noyau immature se désassemble et que les protéines CA libérées se réassemblent en une capside mature morphologiquement distincte. L'assemblage in vitro avec des dérivés de Gag et CA a été utilisé pour étudier les rétrovirus pendant plus de deux décennies. Dans cette revue, nous examinons la découverte et le développement de trois systèmes modèles majeurs [virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), virus du sarcome de Rous (RSV) et virus du singe Mason-Pfizer (MPMV)] et discutons des caractéristiques et aspects structurels de la voie d'assemblage rétroviral qui ont été découverts en utilisant l'assemblage in vitro. Nous avançons également deux grandes questions non résolues dans le domaine et proposons de futures pistes de recherche.


Résumé

Les virus sont des complexes supramoléculaires hautement ordonnés qui ont évolué pour se propager en détournant la machinerie de la cellule hôte. Bien que les virus soient très divers, se propageant à travers les cellules de tous les règnes de la vie, ils partagent des fonctions et des propriétés communes. A côté de l'intérêt général pour la virologie, les mécanismes viraux fondamentaux prennent une importance croissante dans d'autres disciplines telles que la biomédecine et la (bio)nanotechnologie. Cependant, afin d'utiliser de manière optimale les virus et les particules pseudo-virales, par exemple comme véhicule pour l'administration ciblée de médicaments ou comme éléments constitutifs de l'électronique, il est essentiel de comprendre leurs propriétés et caractéristiques chimiques et physiques de base. Dans ce contexte, le nombre d'études portant sur les mécanismes régissant les propriétés et les processus viraux a récemment augmenté de façon drastique. Cette revue résume une partie spécifique de ces réalisations scientifiques, abordant notamment les approches de virologie physique visant à comprendre l'auto-assemblage des virus et les propriétés mécaniques des particules virales. Dans une perspective physico-chimique, nous nous sommes concentrés sur des études fondamentales donnant un aperçu des bases moléculaires régissant ces aspects clés des systèmes viraux.

  • Nanomatériaux inspirés de la biologie et structures à base de protéines et de virus
  • Approches nanotechnologiques de la biologie et des systèmes à l'échelle nanométrique en biologie

Assemblage de virus in vitro - Biologie

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Les articles du Choix de l'éditeur sont basés sur les recommandations des éditeurs scientifiques des revues MDPI du monde entier. Les rédacteurs en chef sélectionnent un petit nombre d'articles récemment publiés dans la revue qui, selon eux, seront particulièrement intéressants pour les auteurs ou importants dans ce domaine. L'objectif est de fournir un aperçu de certains des travaux les plus passionnants publiés dans les différents domaines de recherche de la revue.


Lectures

Lors de la première séance de cours, les instructeurs et les étudiants se présenteront. Les instructeurs présenteront le cours et passeront en revue les exigences et les attentes décrites dans le programme. Les instructeurs présenteront ensuite une brève conférence décrivant le contexte et les bases de la structure et de l'assemblage des virus. Enfin, le thème de la semaine 2 sera introduit.

Principes de la symétrie virale

Watson et Crick ont ​​remarqué que l'acide nucléique viral ne pouvait pas coder une seule protéine assez grosse pour contenir un virus et ont suggéré que plusieurs sous-unités identiques polymérisent en une structure pour abriter l'acide nucléique viral. Caspar et Klug ont proposé un formalisme géométrique, appelé quasi-équivalence, pour expliquer comment 1) une capside sphérique peut être construite à partir de pentamères et d'hexamères et 2) une protéine peut participer à des interactions non équivalentes.

Caspar, D.L. et A. Klug. "Principes physiques dans la construction de virus réguliers." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 27 (1962): 1-24.

Liddington, R.C., Y. Yan, J. Moulai, R. Sahli, T.L. Benjamin et S.C. Harrison. "Structure du virus simien 40 à une résolution de 3,8 A." La nature 354 (1991): 278-84.

Cristallographie virale et cryo-EM

La cristallographie, et plus récemment la cryomicroscopie électronique, sont des techniques utilisées pour déterminer les structures des virus. Au moment où Wikoff et ses collègues ont résolu la structure d'un virus entier, HK97, c'était la plus grande structure jamais résolue par cristallographie. Cryo-EM, bien que pas aussi haute résolution, fournit des informations à partir d'échantillons hydratés congelés sans avoir besoin de cristaux. Wu et al. déterminé la structure d'un virus de l'herpès et montré les emplacements des sous-unités au sein de la structure.

Wikoff, W.R., L. Liljas, R.L. Duda, H. Tsuruta, R.W. Hendrix et J.E. Johnson. "Anneaux protéiques liés topologiquement dans la capside du bactériophage HK97." Science 289 (2000): 2129-33.

Wu, L., P. Lo, X. Yu, J. K. Stoops, B. Forghani et Z. H. Zhou. "Structure tridimensionnelle de la capside de l'herpèsvirus humain 8." J Virol 74 (2000): 9646-54.

Les capsides doivent être construites à partir de leurs composants. Ils se forment sans aucune aide ou énergie extérieure dans un processus souvent appelé « auto-assemblage ». Prevelige et King ont développé l'un des premiers systèmes d'assemblage in vitro pour un virus icosaédrique. Conway et ses collègues ont utilisé cryo-em pour étudier les conformations des capsides virales au fur et à mesure de leur maturation, un processus qui entraîne l'expansion et une rigidité accrue de la coque virale.

Conway, J.F., R.L. Duda, N. Cheng, R.W. Hendrix et A.C. Steven. "Contrôle protéolytique et conformationnel de la maturation de la capside virale: le système bactériophage HK97." J Mol Biol 253 (1995): 86-99.

Prevelige, P.E., Jr., D. Thomas et J.A. King. "Phases de nucléation et de croissance dans la polymérisation de sous-unités de manteau et d'échafaudage en coquilles de procapside icosaédriques." Biophys J 64, non. 3 (1993) : 824-35.

En prolongeant les principes décrits par Caspar et Klug, Ganser et al. proposer un modèle de cône fullerène pour le noyau VIH. Ils ont ensuite prouvé leur modèle à l'aide d'une technique avancée de cryo-EM appelée cryotomographie.

Ganser, B. K., S. Li, V. Y. Klishko, J. T. Finch et W. I. Sundquist. "Assemblage et analyse de modèles coniques pour le noyau VIH-1." Science 283 (1999): 80-3.

Benjamin, J., B.K. Ganser-Pornillos, W.F. Tivol, W.I. Sundquist et G.J. Jensen. "Structure tridimensionnelle des particules de type virus VIH-1 par cryotomographie électronique." J Mol Biol 346 (2005): 577-88.

Les virus ont développé différentes stratégies pour introduire leurs acides nucléiques dans les coquilles. Les bactériophages utilisent généralement une enveloppe protéique préformée, appelée procapside, dans laquelle le génome d'ADN est pompé par un complexe de protéines appelées portail et terminase. À l'aide de pincettes optiques, Smith et al. montrent qu'un tel moteur d'emballage est incroyablement puissant. Les rétrovirus ont des mécanismes totalement différents basés sur les interactions entre la structure secondaire de l'ARN et les protéines qui composent la coquille environnante. Ces interactions protéine-acide nucléique sont une composante essentielle de l'assemblage et de l'encapsidation simultanés d'un rétrovirus et de son génome.

D'Souza, V., et M. F. Summers. "Base structurelle pour l'empaquetage du génome dimère du virus de la leucémie murine de Moloney." La nature 431, non. 7008 (2004) : 586-90.

Smith, D.E., S.J. Tans, S.B. Smith, S. Grimes, D.L. Anderson et C. Bustamante. "Le moteur portail phi29 droit du bactériophage peut emballer l'ADN contre une grande force interne." La nature 413 (2001): 748-52.

Reconnaissance de virus et pièce jointe

La première étape d'une infection virale est la reconnaissance et l'attachement à une cellule hôte. Le bactériophage P22 utilise une protéine caudale qui reconnaît et clive spécifiquement le lipopolysaccharide à la surface de son hôte, Salmonella typhimurium, lui permettant de « creuser » jusqu'à la surface cellulaire. Steinbacher et ses collègues ont déterminé la structure de la protéine en complexe avec son substrat, révélant la base moléculaire de la spécificité. L'attachement par les virus de la dengue se fait par une méthode tout aussi élégante. Contrairement au tailspike, les protéines qui accomplissent cette tâche subissent un réarrangement structurel majeur lors de l'interaction avec l'hôte. Cette restructuration de la protéine déclenche la fusion membranaire, une étape critique dans le processus d'infection.

Modis, Y., S. Ogata, D. Clements et S.C. Harrison. "Structure de la protéine d'enveloppe du virus de la dengue après fusion membranaire." La nature 427, non. 6972 (2004) : 313-9.

Steinbacher, S., U. Baxa, S. Miller, A. Weintraub, R. Seckler et R. Huber. "Structure cristalline de la protéine tailspike du phage P22 complexée avec les récepteurs de l'antigène O de Salmonella sp.." Proc Natl Acad Sci U S A 93, non. 20 (1996) : 10584-8.

Une fois que les virus se fixent à leurs hôtes, ils doivent faire entrer leur acide nucléique à l'intérieur de la cellule. Encore une fois, les virus ont développé des solutions très diverses à ce problème. Le poliovirus, un picornavirus, utilise un peptide qui se lie aux membranes et induit la cellule à internaliser la particule par la voie endocytotique. Le bactériophage T4 crée plutôt un canal à travers les membranes de son hôte et libère son ADN dans la cellule. Petr Leiman et ses collègues ont utilisé la cryo-EM pour révéler les changements structurels remarquables qui accompagnent les complexes protéiques de la queue T4 qui accomplissent cet exploit.

Bubeck, D., D.J. Filman, N. Cheng, A.C. Steven, J.M. Hogle et D.M. Belnap. "La structure de l'intermédiaire d'entrée cellulaire du poliovirus 135S à une résolution de 10 angströms révèle l'emplacement d'un polypeptide externalisé qui se lie aux membranes." J Virol 79, non. 12 (2005) : 7745-55.

Leiman, P.G., P.R. Chipman, V.A. Kostyuchenko, V.V. Mesyanzhinov et M.G. Rossmann. "Réarrangement tridimensionnel des protéines dans la queue du bactériophage T4 lors de l'infection de son hôte." Cellule 118, non. 4 (2004) : 419-29.

Structures virales dans la cellule

Les virus sont des parasitaires moléculaires et utiliseront toutes les voies cellulaires qu'ils peuvent. La protéine de capside T4 nécessite un chaperon pour se replier, mais le chaperon hôte est trop petit. Comment T4 résout-il ce problème ? Il possède un gène codant pour une coiffe chaperon qui interagit avec le chaperon hôte, créant un espace plus grand dans lequel s'adapter la protéine de capside T4 pour le repliement. Le virus de la peste porcine africaine utilise un mécanisme cellulaire mal compris pour aider au repliement et à l'assemblage de ses capsides : l'agresseur. Considérées comme un mécanisme cellulaire pour traiter les protéines mal repliées, ces structures intracellulaires sont induites lors de l'infection par le virus ASFV et sont les sites d'assemblage de la capside.

Bakkes, P.J., B.W. Faber, H. van Heerikhuizen et S.M. van der Vies. "La cochaperonine codée en T4, gp31, possède des propriétés uniques qui expliquent son exigence pour le repliement de la protéine de capside majeure T4." Proc Natl Acad Sci U S A 102, non. 23 (2005) : 8144-9.

Heath, C.M., M. Windsor et T. Wileman. "Les agresseurs ressemblent à des sites spécialisés pour l'assemblage de virus." J Cell Biol 153, non. 3 (2001) : 449-55.

Une fois qu'un virus s'assemble à l'intérieur d'une cellule, il doit en sortir. Les bactériophages ont un système simple mais robuste pour lyser leurs hôtes, les faisant littéralement exploser. Ce système dispose d'un mécanisme de contrôle intégré permettant une synchronisation efficace de la lyse. Le VIH semble exploiter une voie cellulaire auparavant mal comprise pour le bourgeonnement à partir des cellules. Von Schwedler et al. utiliser la génétique pour identifier plus d'une vingtaine d'acteurs protéiques dans cette voie très complexe.

Grundling, A., D. L. Smith, U. Blasi et R. Young. "Dimérisation entre le holin et l'inhibiteur de holin du phage lambda." J Bactériol 182, non. 21 (2000) : 6075-81.

von Schwedler, Royaume-Uni, M. Stuchell, B. Muller, DM Ward, HY Chung, E. Morita, HE Wang, T. Davis, GP He, DM Cimbora, A. Scott, HG Krausslich, J. Kaplan, SG Morham, et WI Sundquist. "Le réseau de protéines du VIH en herbe." Cellule 114, non. 6 (2003) : 701-13.

Virus de l'immunodéficience humaine

En rassemblant ce que nous avons appris sur la structure et l'assemblage du virus, nous discuterons des composés antiviraux du VIH à la lumière de leurs mécanismes. Les inhibiteurs de fusion virale étaient autrefois une thérapie anti-VIH prometteuse. Mais le VIH a rapidement développé une résistance, et la base de cette résistance est comprise en termes de structure de la protéine qui a muté, gp41. Sticht et al. rapportent un peptide antiviral prometteur qui inhibe l'assemblage de la capside du VIH.

Baldwin, C.E., R.W. Sanders, Y. Deng, S. Jurriaans, J.M. Lange, M. Lu et B. Berkhout. « L'émergence d'un variant de type 1 du virus de l'immunodéficience humaine pharmacodépendante au cours d'un traitement avec l'inhibiteur de fusion T20. » J Virol 78, non. 22 (2004) : 12428-37.

Sticht, J., M. Humbert, S. Findlow, J. Bodem, B. Muller, U. Dietrich, J. Werner et H.G. Krausslich. "Un inhibiteur peptidique de l'assemblage du VIH-1 in vitro." Nat Struct Mol Biol 12, non. 8 (2005) : 671-7.

Journée du projet : examiner les structures virales en 3D

La manipulation visuelle de biomacromolécules en 3D est un outil important pour les biologistes structurels. Nous passerons cette période de classe à nous familiariser avec un logiciel de niveau recherche qui nous permet de faire pivoter, manipuler et visualiser des molécules en 3 dimensions, et nous examinerons au niveau moléculaire certaines des protéines virales discutées au cours du semestre.

Les virus sont essentiellement des machines biologiques. Le contrôle génétique de leurs structures, couplé à la fidélité avec laquelle ces structures s'auto-assemblent, font des virus des plateformes idéales pour le développement de matériaux et de surfaces à l'échelle nanométrique.

Mao, C., D.J. Solis, B.D. Reiss, S.T. Kottmann, R.Y. Sweeney, A. Hayhurst, G. Georgiou, B. Iverson et A.M. Belcher. "Boîte à outils basée sur les virus pour la synthèse dirigée de nanofils magnétiques et semi-conducteurs." Science 303, non. 5655 (2004) : 213-7.

Meunier, S., E. Strable et M.G. Finn. « La réticulation et le couplage aux protéines de capside virales par oxydation de la tyrosine. » Chimie Bio 11, non. 3 (2004) : 319-26.


Méthodes

Protéines et ADN recombinant

Le clonage, la surexpression et la purification de la protéine d'enveloppe de PP7 ont été décrits en détail ailleurs. Pour construire le dimère PP7 monocaténaire, la séquence de revêtement a été amplifiée à partir de pP7CT avec l'ADN polymérase Pfu et une amorce 3' complémentaire des séquences du vecteur plasmidique et une amorce 5' ayant la séquence : 5'-CCCCCGCCGTTATGGGCAAAACCATCGTTCTTTCGGTC-3'. Cela a introduit un Bgl Je site près de l'extrémité 5' de ce qui serait la copie en aval de la séquence codant pour la protéine d'enveloppe. Ceci a été par la suite joint à un naturel Bgl Je site près de l'extrémité 3' de la copie en amont dans pP7CT pour créer la séquence de jonction illustrée à la figure 3. La séquence maintenant dupliquée a été clonée entre Xba moi et Bam HI dans pET3d pour la surexpression dans E. coli. Ces manipulations ont abouti à la duplication et à la fusion traductionnelle des deux séquences, le dernier acide aminé de la copie amont (arginine) étant joint au deuxième acide aminé (sérine) de la copie aval via un linker à deux acides aminés (tyr-gly) .

Test de stabilité thermique

Les stabilités thermiques des particules pseudo-virales dans diverses conditions ont été déterminées par deux méthodes. Dans le premier, un "profil de fusion" a été produit en chauffant des échantillons de 25 ul de particules de type virus PP7 à une concentration de 1,0 mg/ml dans 50 mM de Tris-HCl, pH 8,5, 100 mM de NaCl pendant 2 min. à des températures spécifiques. Lorsqu'une réaction contenait du DTT, il était présent à une concentration de 10 mM. A la fin de la période d'incubation, les échantillons ont été refroidis sur glace puis soumis à une centrifugation à 13 000 rpm dans une microcentrifugeuse IEC MicroMax pendant 5 minutes. Les surnageants de ces échantillons, contenant la partie de la protéine restée soluble après traitement thermique, ont été prélevés dans un nouveau tube. Les protéines insolubles dans le culot ont été redissoutes dans 6 M d'urée. Les mesures des quantités relatives de protéines solubles et insolubles ont été réalisées par dosage de Bradford [24]. Des courbes standard ont été produites en utilisant du lysozyme de poule comme standard et étaient linéaires sur toute la plage de l'essai. Pour mesurer la quantité de capsides restant après traitement thermique, la protéine soluble a été appliquée à un gel d'agarose à 1 % dans du Tris-acétate 40 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, et soumise à une électrophorèse. Le gel a ensuite été coloré au bromure d'éthidium et photographié sous éclairage UV pour visualiser les VLP contenant de l'ARN. La protéine a été colorée avec du bleu brillant de Coomassie R250. Le gel a été scanné avec un densitomètre et la quantité de protéine dans les bandes individuelles a été déterminée par comparaison à une courbe standard produite en appliquant des dilutions d'une quantité connue de particules de type virus PP7 au même gel. La courbe standard était linéaire sur la plage utilisée dans l'essai.

Les taux de dénaturation ont été déterminés par incubation de protéines dans 50 mM de Tris-HCl, pH 8,5, 100 mM de NaCl, avec ou sans DTT à 10 mM à des températures spécifiées. A certains moments, les réactions ont été trempées sur de la glace puis analysées pour leur teneur en capsides et en protéines solubles et insolubles comme décrit ci-dessus.

Purification des dimères

Dix milligrammes de VLP PP7 ou 2PP7 purifiées comme décrit précédemment ont été incubés pendant 60 minutes dans 1 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, urée 6 M, DTT 10 mM sur glace. La protéine résultante a été dialysée contre 10 mM d'acide acétique, 50 mM de NaCl (environ pH 4), puis appliquée à une colonne de 0,9 x 45 cm de Sephadex G75 et éluée dans le même tampon. Des fractions de 0,7 ml ont été recueillies. Deux pics sont apparus dans le chromatogramme. L'électrophorèse sur gel d'agarose montre que le premier pic est constitué de VLP qui n'ont pas réussi à se désassembler. L'autre, éluant à la fraction 20, représente apparemment des dimères de protéines d'enveloppe. Dans une expérience séparée, de l'albumine de sérum bovin (PM = 68 000), de l'ovalbumine (PM = 45 000), du chymotrypsinogène (PM = 25 700) et du lysozyme (PM = 14 400) ont été appliqués à la colonne comme étalons de poids moléculaire. Les protéines standard ont donné un tracé linéaire de la position d'élution en fonction du log du poids moléculaire. Notez que la BSA a été omise de cette analyse car elle s'est éluée dans ou près du volume vide. Une comparaison avec le comportement d'élution des standards indique que le deuxième pic de protéine d'enveloppe a un poids moléculaire d'environ 32 000, une taille à peu près cohérente avec le poids moléculaire prédit d'environ 28 000 pour le dimère de protéine d'enveloppe. La protéine des fractions de pic a été utilisée dans le in vitro réactions d'assemblage.

In vitro Assemblage VLP

La protéine d'enveloppe PP7 dimère purifiée (0,1 nmol) a été ajoutée à des réactions contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 et de l'ARNt de levure, l'opérateur traductionnel MS2 ou l'ARN opérateur traductionnel PP7 en quantités variant par une dilution en série double de 0,1 nmol à 6,3 pmol . Après 30 minutes, du glycérol et du bleu de bromophénol ont été ajoutés et les réactions ont été soumises à une électrophorèse dans un gel d'agarose à 1 %. L'ARN a été visualisé en colorant les gels avec du bromure d'éthidium suivi d'une photographie sur un transilluminateur UV. Les ARN des opérateurs traductionnels MS2 et PP7 ont été produits par transcription in vitro comme décrit précédemment [26]. Dans certains cas, les ARN ont été synthétisés en présence d'un nucléotide marqué au 32P et ont pu être visualisés et quantifiés après exposition du gel à un écran phosphorimager Packard Cyclone. Pour visualiser les protéines, les gels ont été colorés avec du bleu brillant de coomassie R250.


In vitro Propriétés d'assemblage de protéines de capside purifiées exprimées de manière bactérienne du virus de l'immunodéficience humaine

La polyprotéine Gag des rétrovirus est suffisante pour l'assemblage et le bourgeonnement de particules pseudo-virales à partir de la cellule hôte. Dans le cas du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), Gag contient les domaines matrice, capside (CA), nucléocapside (NC) et p6 qui sont séparés par la protéinase virale à l'intérieur du virion naissant, conduisant à une maturation morphologique pour donner un virus infectieux. Dans le virus mature, CA forme une enveloppe de capside entourant le noyau ribonucléoprotéique constitué de NC et de l'ARN génomique. Pour définir les exigences pour l'assemblage des particules et les contributions fonctionnelles des domaines individuels, nous avons exprimé les domaines de HIV Gag dans Escherichia coli et purifié les produits jusqu'à une quasi-homogénéité. In vitro l'assemblage de CA, avec ou sans le peptide espaceur C-terminalement adjacent, a donné des structures tubulaires d'un diamètre d'environ 55 nm et d'une longueur hétérogène. La formation efficace des particules nécessitait une concentration élevée en protéines, une teneur élevée en sel et un pH neutre à alcalin. En revanche, in vitro l'assemblage de CA-NC s'est produit à une concentration de protéines 20 fois plus faible et à faible teneur en sel, mais a nécessité l'ajout d'ARN. Ces résultats suggèrent que les interactions hydrophobes des protéines de capside sont suffisantes pour la formation de particules tandis que le domaine de la nucléocapside de liaison à l'ARN peut concentrer et aligner les protéines structurelles sur le génome viral.


Résumé

La synthèse d'une petite quantité d'ARN 42S en plus de l'espèce d'ARNm spécifique du VSV a été observée dans un système de transcription-traduction couplé contenant des particules de ribonucléoprotéine provenant de cellules L infectées par le virus de la stomatite vésiculeuse et un extrait ribosomique traité à la nucléase obtenu à partir de cellules HeLa non infectées. L'analyse sur un gradient de densité de CsCl a montré que l'ARN 42S synthétisé était associé à la protéine N nouvellement synthétisée en tant que nucléoprotéine de densité flottante de 1,3 g/ml. L'ARN 42S et la protéine N présents dans la nucléoprotéine étaient respectivement résistants à la nucléase et à la protéase. Environ 35 % de l'ARN 42S synthétisé avaient la même polarité que l'ARN génomique du VSV et les 65 % restants avaient une polarité complémentaire. Les preuves présentées ici démontrent qu'à la fois l'ARN génomique complet et l'ARN complémentaire sont associés à la protéine N dans le processus de réplication in vitro. Un rôle de matrice pour l'ARN 42S complémentaire pour la réplication de l'ARN génomique est également suggéré.


Introduction

Les in vitro la construction de ribosomes est un sujet d'intérêt croissant pour les systèmes et la biologie synthétique. Ces intérêts visent à élucider les grands principes qui sous-tendent le fonctionnement et l'assemblage de l'appareil de traduction ( Nierhaus, 1990 Erlacher et al, 2011 Polacek, 2011 ), concevoir et construire des cellules minimales pour comprendre les origines de la vie ( Forster et Church, 2006 Jewett et Forster, 2010 ), et permettre in vitro évolution pour sélectionner des ribosomes qui ont des fonctions améliorées ou des propriétés chimiques modifiées ( Cochella et Green, 2004 Wang et al, 2007 Neumann et al, 2010 ). Pour atteindre ces objectifs, des méthodes de in vitro synthèse des ribosomes sont nécessaires.

In vitro l'assemblage ou la reconstitution de Escherichia coli ribosomes à partir de composants ribosomiques natifs purifiés en sous-unités ribosomiques petites (30S) et grandes (50S) fonctionnellement actives a été obtenu pour la première fois dans des travaux pionniers il y a environ 40 ans. Le protocole conventionnel de reconstitution de la sous-unité 30S implique une incubation en une étape à 20 mM Mg 2+ et 40 °C (Traub et Nomura, 1968), et peut être facilité à des températures plus basses par des chaperons (Maki et Culver, 2005). Le protocole conventionnel de reconstitution de la sous-unité 50S implique une incubation non physiologique à haute température en deux étapes, d'abord à 4 mM Mg 2+ et 44 °C, puis à 20 mM Mg 2+ et 50 °C (Nierhaus et Dohme, 1974).

Alors que les études utilisant l'approche de reconstitution conventionnelle ont révélé de nombreuses informations importantes sur l'assemblage des ribosomes (Nierhaus, 1990), les inefficacités dans la reconstitution rendent la construction et l'analyse de variantes modifiées difficiles (Semrad et Green, 2002). Par exemple, des sous-unités 50S reconstituées de manière conventionnelle faites avec in vitro-les ARNr 23S transcrits (sans les modifications post-transcriptionnelles naturelles) sont jusqu'à 10 000 fois moins efficaces pour la reconstitution que ceux utilisant l'ARNr 23S mature tel que mesuré par la réaction des fragments, où des liaisons peptidiques simples sont formées sur des sous-unités 50S isolées (Semrad et Vert, 2002). En outre, les conditions non physiologiques en deux étapes pour l'assemblage 50S excluent le couplage de la synthèse et de l'assemblage des ribosomes dans un seul système intégré.

Contrairement aux schémas précédents, nous avons cherché à développer une méthode intégrée pour l'assemblage physiologique de E. coli ribosomes, dans lesquels les ribosomes s'assemblent à partir de in vitro-ARNr transcrit et ensuite effectuer la synthèse des protéines dans le même compartiment (Encadré 1). Cette approche imite la co-transcription de l'ARNr et de l'assemblage du ribosome au fur et à mesure qu'elle se produit in vivo (Talkington et al, 2005 Mulder et al, 2010 ). De plus, il est aligné sur un principe directeur général de la biologie synthétique sans cellule, à savoir que le mimétisme cytoplasmique offre des avantages pour la reproduction d'un comportement de type cellulaire (Jewett et al, 2008 Hodgman et Jewett, 2012 ). Ici, nous démontrons notre nouvelle méthode pour la synthèse intégrée d'ARNr, l'assemblage de ribosomes et la traduction, appelée iSAT (encadré 1). De plus, nous montrons comment iSAT peut être utilisé pour fabriquer efficacement un ribosome modifié hautement résistant à l'antibiotique clindamycine en une seule étape. Même si Bacillus stearothermophilus (Green et Noller, 1999) et Thermus aquatique (Khaïovitch et al, 1999 Erlacher et al, 2011 ) ont des ribosomes assez actifs reconstitués à partir de in vitro-ARNr 23S transcrit sans modifications, nous nous concentrons sur E. coli ribosomes parce que l'appareil de traduction de E. coli est le mieux compris et le plus caractérisé à la fois biochimiquement et génétiquement ( Forster et Church, 2006 Jewett et Forster, 2010 ).


Assemblage de virus in vitro - Biologie

Instantané de données expérimentales

  • Méthode : MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE
  • Résolution : 3.30 Å
  • État d'agrégation : RESEAU HELICAL 
  • Méthode de reconstruction : HELIQUE 

Validation wwPDB   Rapport 3D Rapport complet

L'assemblage et les structures cryo-EM des nucléocapsides du virus de la rougeole spécifiques à l'ARN fournissent un aperçu mécanistique de la réplication paramyxovirale.

(2019) Proc Natl Acad Sci U S A 116: 4256-4264

  • PubMed: 30787192  Recherche sur PubMedRecherche sur PubMed Central
  • DOI : 10.1073/pnas.1816417116
  • Citation principale des structures connexes :  
    6H5Q, 6H5S
  • Résumé PubMed : 

L'assemblage des nucléocapsides paramyxoviraux sur le génome à ARN est une étape essentielle du cycle viral. La base structurelle de ce processus est restée obscure en raison de l'incapacité de contrôler l'encapsidation. Nous avons utilisé une approche récemment développée pour assembler des particules de type nucléocapside du virus de la rougeole sur des séquences spécifiques d'hexamères d'ARN (poly-Adénine et génomique virale 5') in vitro, et déterminé leurs cartes de microscopie cryoélectronique à 3 .

L'assemblage des nucléocapsides paramyxoviraux sur le génome à ARN est une étape essentielle du cycle viral. La base structurelle de ce processus est restée obscure en raison de l'incapacité de contrôler l'encapsidation. Nous avons utilisé une approche récemment développée pour assembler des particules de type nucléocapside du virus de la rougeole sur des séquences spécifiques d'hexamères d'ARN (poly-Adénine et génomique virale 5') in vitro, et déterminé leurs cartes de microscopie cryoélectronique à une résolution de 3,3 Å. Les structures déterminent sans ambiguïté les sites de liaison 5' et 3' et ainsi le registre de liaison de l'ARN génomique viral dans les nucléocapsides. Cette observation révèle que l'extrémité 3' du génome est largement exposée dans les nucléocapsides de la rougeole entièrement assemblées. En particulier, les trois derniers nucléotides du génome sont rendus accessibles au complexe ARN polymérase ARN-dépendante, permettant éventuellement un traitement efficace de l'ARN. Les structures révèlent également des changements conformationnels locaux et globaux de la nucléoprotéine lors de l'assemblage, impliquant en particulier l'hélice α6 et l'hélice α13 qui forment les bords du sillon de liaison à l'ARN. Un trouble est observé dans l'ARN lié, localisé à l'un des deux sites de commutation conformationnels du squelette. La structure à haute résolution nous a permis d'identifier des sites d'interaction putatifs de nucléobases dans le sillon de liaison à l'ARN, dont l'impact sur la cinétique d'assemblage a été mesuré par RMN en temps réel. La mutation de l'un de ces sites, R195, dont la chaîne latérale stabilise à la fois le squelette et la base d'un acide nucléique lié, s'avère ainsi essentielle pour l'assemblage de particules de type nucléocapside.


Voir la vidéo: CUANTO ME COSTO MI FECUNDACION IN VITRO? (Février 2023).